N-terminal sekventering, ofte omtalt som Edman-sekventering eller Edman-nedbrydning er en vigtig teknik i proteinundersøgelse og forbliver en unik tilgang, der kan give nye proteinsekvensdata. Det er også den foretrukne teknik til hurtig proteinekspressionsbekræftelse.
kemien i denne tilgang blev først introduceret i 1950 af P. Edman fra Lund Universitet i Sverige og videreudviklet under sit arbejde i Melbourne, Australien til det, der menes at være den første automatiserede peptidsekventeringsenhed.
Edmans Kemi
Fig 1. Edman nedbrydningskemi til N-terminal proteinsekventering.
de kemiske reaktioner, der giver den hydroliserede N-terminale mærkede aminosyre, er vist i fig 1. Hver cyklus indeholder i det væsentlige 3 trin:
- kobling af phenylisothiocyanatet (PITC, Edman-reagens) til alfa-aminen i polypeptidkæden under basale betingelser for at danne en phenylthiocarbamyl (PTC) – del.
- spaltning under milde sure betingelser genererer en fri amino-terminal på polypeptidet og en anilinothiasolinon (ATS) adduceret aminosyre.
- sidstnævnte ekstraheres og omdannes yderligere til et mere stabilt phenylthiohydantoin (PTH) derivat.
den resulterende PTH-rest analyseres ved HPLC og retentionstider sammenlignet med standarderne for PTH-aminosyrer.
bivirkninger og biprodukter
sekventeringscykluskemi og oparbejdning er godt kontrolleret og giver perfekt definerede arter, der er et par biprodukter, der detekteres under analysen.
som vist i figur 2 kommer de hovedsageligt fra PITC-hydrolyse og methanolyse under cyklussen og inkluderer diphenylthiourinstof (DPTU), N-phenyl, o-methyl-thiocarbonat (PMTC) og diphenylurinstof (DPU), biprodukter, der Co-ekstraherer og co-eluerer med PTH-aminosyrer.
