flerfarvet farvning med fluorescerende farvestoffer anvendes aktivt til at observere fordelingen af biologiske materialer (såsom proteiner, lipider, nukleinsyrer og ioner) inden for vævs-og celleforskning. Detektionsteknologien til fluorescensobservation er avanceret til et niveau, hvor et enkelt fluorescerende farvestofmolekyle kan detekteres under de bedste omstændigheder. Dette afsnit gennemgår flere af de vigtige aspekter af fluorescens lifetime imaging microscopy (FLIM), en ny fluorescensmikroskopiteknologi. Ud over flerfarvet farvning kan fluorescens levetid billeddannelse også bruges til at visualisere de faktorer, der påvirker fluorescens levetid egenskaber af farvestofmolekylet, det vil sige tilstanden af miljøet omkring molekylet.
Bølgelængdespektroskopi
konventionel fluorescensmikroskopi gør brug af farveegenskaberne for fluorescerende farvestoffer, dvs.identifikation er baseret på forskelle i fluorescensspektrale egenskaber mellem farvestoffer. Med denne teknik kan fem eller seks farvestoffer i bølgelængdeområdet fra ultraviolet til nær infrarød bruges samtidigt under mikroskopi uden forvirring mellem farver.
Livstidsspektroskopi
hvert fluorescerende farvestof har sin egen levetid i ophidset tilstand. Ved at detektere forskelle i levetid er det muligt at skelne lige farvestoffer med samme fluorescerende farve såvel som at identificere autofluorescens. Desuden kan billeder med højt signal til støj opnås ved hjælp af en sonde med meget lang levetid sammenlignet med de fluorescerende farvestoffer, der normalt anvendes. For eksempel har platinum coproporphyrin en levetid på millisekund orden, mens levetiden for almindelige fluorescerende farvestoffer er af nanosekund orden. Sådanne relativt langlivede fluorescerende farvestoffer vil snart blive brugt som prober til DNA-detektion på chips.
fluorescens levetid billeddannelse gør det også muligt at få information om molekylerne, mens man observerer en levende celle. De faktorer, der påvirker fluorescens levetid, inkluderer ionintensitet, hydrofobe egenskaber, iltkoncentration, molekylær binding og molekylær interaktion ved energioverførsel, når to proteiner nærmer sig hinanden. Levetiden er dog uafhængig af farvestofkoncentration, fotoblegning, lysspredning og lysintensitet. Derfor tillader fluorescens levetid billeddannelse os at udføre nøjagtig ionkoncentrationsmåling og Fluorescensresonans energioverførsel (FRET) analyse.
der er to metoder til fluorescens levetid billeddannelse: tidsdomænemetoden og frekvensdomænemetoden.
- tidsdomæne FLIM-i nogle tilfælde af forsinkelse efter ophidselse af en pulslaser kan fluorescensbilledet opnås ved portoperationen af billedforstærkeren. Levetiden måles i nanosekunder af en laser med en pulsvarighed på et par hundrede picosekunder og en lukker på nanosekundniveau, fordi levetiden for en eksitationstilstand normalt er 1 til 20 nanosekunder. En high-speed gate billedforstærker er kommercielt tilgængelig fra Hamamatsu Photonics K. K. (Hamamatsu, Japan). Fluorescenslevetiden ved hvert punkt kan også opnås ved at måle, mens forsinkelsestiden varieres, indtil en port åbnes. Fluorescens levetid billeder er vist i pseudocolor i henhold til deres levetid.
- frekvensdomæne FLIM-fluorescens levetid beregnes ved at måle faseforskydningen af fluorescens og reduktionen i dens amplitude ved hjælp af en detektor med en forstærkningsmodulator, når laseren, der anvendes som eksitationslyskilde, moduleres (1 til 200 megahert). Målingen kan foretages enten ved laserscanning (fotomultiplikator) eller ved hjælp af en ladekoblet enhed (CCD).
applikationer
miljøet omkring sonden detekteres baseret på det faktum, at fluorescens levetid er følsom over for hydrogenionkoncentration (pH), ilt og calciumionkoncentrationer. Bindingen eller interaktionen mellem molekyler kan også måles i kombination med FRET.
billeddannelse af Calciumionkoncentration
når calciumionen binder til en fluorescerende sonde, såsom Fura-2, Fluo-3 eller Calciumgrøn, ændres både fluorescenslevetiden og fluorescensintensiteten. Den konventionelle procedure til måling af ionkoncentration fokuserer på ændringen i intensitet. I henhold til ændringen af calciumionkoncentrationen ændres forholdet mellem farvestoffer mellem bundet og ubundet calciumion, og dette fører efterfølgende til en ændring i fluorescenslevetiden for målepunktet i prøven. Ud over calciumionproben er denne teknik også anvendelig til måling af pH og andre ioner, såsom natriumion og magnesiumion.
Fluorescensresonans energioverførsel (FRET)
forskning udføres i øjeblikket på FRET af grønt fluorescerende protein (GFP) varianter (GFP med en anden fluorescensfarve). FRET gør det muligt at måle interaktionerne (forening eller dissociation) mellem to proteiner, der er mærket med et par fluorescensfarvestoffer. En donor fluorescerende farvestof har kortere spænding / emission bølgelængder, der giver energi til en acceptor fluorescens farvestof. Levetiden for donorfarvestoffets eksitationstilstand er variabel afhængigt af, om acceptoren (farvestoffet, der modtager energien) findes eller ej. Måling baseret på levetid muliggør bedre kvantificering, fordi det ikke er nødvendigt at overveje overlapningen af fluorescens under påvisning.
klinisk billeddannelse
da nogle vævs-og cytodiagnostiske prøver har stærk autofluorescens, er brugen af prober med lang levetid (op til millisekunder) blevet forsøgt. Prober med lang levetid er også nyttige til fluorescens in situ hybridisering (fisk), fordi antallet af farver, der kan bruges samtidigt, er begrænset med denne teknik. Hydrogenionkoncentrationen i blod såvel som ilt-og kultveiltetrykket er allerede blevet målt baseret på fluorescens levetid, skønt sådanne målinger stadig ikke er mulige under mikroskopi.
internetressourcer
- Center for Fluorescensspektroskopi-hostet af Professor Joseph R. Ved University of Maryland, denne hjemmeside er en fremragende ressource for information om fluorescens levetid billeddannelse og andre aspekter af fluorescens spektroskopi og mikroskopi.
- Kentech Instruments – Kentech fremstiller højspændings solid state pulsgeneratorer og optiske gated imaging systemer til fluorescens levetid imaging.
- Hamamatsu Photonics – ud over deres fremragende lineup af digitale kamerasystemer fremstiller Hamamatsu også fotomultiplikatorer, lavine fotodioder og højhastigheds gate billedforstærkere.
- PRS BioSciences – PRS BioSciences har specialiseret sig i biologisk fluorescensmikroskopi og fremstiller et eftermarkedssystem, der kan tilpasses mange forskningsmikroskoper.
