Fremskridt inden for genomisk test – hvad du har brug for at vide

fremskridt inden for genomisk test-hvad du har brug for at vide

af Dr. C. H. væver M. D. opdateret 9/1/2018

spørgsmål: Hvad er genomisk test?

A: genomisk test ser på en gruppe gener og deres forskellige ekspressionsniveauer. Denne genekspression eller aktivitet kan karakterisere, hvordan gener interagerer med hinanden og forudsige adfærd af visse væv i kroppen. Dette er i modsætning til genetisk testning, der ser på en specifik ændring inden for et individuelt kromosom eller gen, ofte som en del af et arveligt træk.

spørgsmål: Hvilken rolle spiller genomisk test i en kræftdiagnose?
A: genomisk test kan give information om en patients prognose baseret på genekspression i en persons kræftvæv og kan ofte forudsige, om visse terapi (såsom kemoterapi) vil være til gavn.

spørgsmål: på hvilket tidspunkt i den diagnostiske proces forekommer genomisk test?
A: Genomisk test kan forekomme når som helst efter en vævsprøve (biopsi eller resektion) af kræft er erhvervet.

spørgsmål: Hvilke spørgsmål skal jeg stille mit sundhedsteam om genomisk test?
A: følgende er de primære spørgsmål, du skal stille din sundhedsudbyder.

• er genomisk test tilgængelig for den type kræft, jeg har, for at hjælpe med at bestemme min samlede prognose?
• vil resultaterne af denne test have potentialet til at ændre din behandling af kræft? Specifikt:
  • vil testen kunne fortælle mig, om visse terapier vil være til gavn i min behandling?
• har du haft positive resultater i at bruge denne test med andre patienter?
• er denne test omfattet af min forsikringsplan? (Denne type test kan køre i tusindvis af dollars, selvom mange planer dækker testene uden en out-of-pocket udgift.)

spørgsmål: er der specifikke kræftformer, for hvilke genomisk test er særlig vigtig?

A: Der er tre typer kræftpatienter, for hvilke genomisk test kan være særlig fordelagtig:

• patienter med østrogenreceptorpositiv brystkræft, der endnu ikke har spredt sig til lymfeknuderne (brystkræft i det tidlige stadium), kan have en prognose, der er vanskelig at forudsige ved vævsbiopsi alene. Genomisk test kan ikke kun hjælpe med at give prognostisk information (dvs.forudsagt 10-års overlevelse), men kan også forudsige, om kemoterapi vil være til nogen væsentlig fordel, så en patient kan undgå toksiciteten af kemoterapi, når det er muligt.
• patienter med visse typer tyktarmskræft kan også drage fordel af genomisk test med hensyn til bestemmelse af prognose, forudsigelse af kemoterapifordel og valg af kemoterapi (bestemmelse af hvilke kemiske stoffer der vil være mest gavnlige).
• patienter med kræft, der har spredt sig til andre steder i kroppen (metastatisk sygdom), eller som er gentaget lokalt (på trods af kirurgi og/eller kemoterapi) kan gennemgå genomisk test, der ser på ekspression på tværs af en lang række gener, herunder dem, der ikke typisk er forbundet med det oprindelige kræftsted. Denne type genomisk test kan identificere visse gener, der potentielt kan være et mål for terapi, der oprindeligt ikke blev overvejet. En ændring til en målrettet terapi ville have potentialet til markant at forbedre overlevelsen.

Genomikens nye rolle i diagnosticering og overvågning af kræft

oversigt

kræft er resultatet af genetiske abnormiteter, der påvirker funktionen af bestemte gener. Gener bestemmer cellernes form, funktion og vækstmønstre. De, der fremskynder eller undertrykker vækst, er ofte involveret i kræft. For eksempel har mange kræftformer en abnormitet i et gen, der er ansvarlig for at stimulere cellulær vækst, og/eller genet, der normalt forhindrer kræft, fungerer ikke korrekt. Begge disse genetiske abnormiteter kan resultere i ukontrolleret og overdreven cellulær vækst, kendetegnende træk ved kræft. Genomiske tests eller analyser, som de kaldes af forskere, er et værktøj til at identificere de specifikke gener i en kræft, der er unormale eller ikke fungerer korrekt. I det væsentlige er dette som at identificere den genetiske signatur eller fingeraftryk af en bestemt kræft.

genomisk test er forskellig fra genetisk test. Genetiske tests bruges typisk til at bestemme, om et sundt individ har et arveligt træk (gen), der disponerer dem for at udvikle kræft. Genomiske tests evaluerer generne i en prøve af sygt væv fra en patient, der allerede er diagnosticeret med kræft. På denne måde identificeres gener, der har muteret eller har udviklet unormale funktioner, ud over dem, der kan være arvet.

genomisk test kan hjælpe læger med at:

• Bestem en patients prognose (potentielt resultat)
• Bestem, om en kræft er aggressiv/hurtigt voksende eller langsomt voksende
• Vælg den mest effektive behandling for hver enkelt kræft
• Overvåg patienter, der er under behandling for at afgøre, om behandlingen fungerer
• Overvåg patienter, der er i remission for at fange en potentiel sygdomsprogression tidligt, når det er mere behandles

måske er det største løfte om genomisk test dets potentiale for individualisering af behandlingen. Dette betyder, at patienter med mere alvorlige tilstande kan identificeres og tilbydes aggressive og innovative terapier, der kan forlænge deres liv, mens patienter, der diagnosticeres med en mindre alvorlig tilstand, kan skånes for unødvendige behandlinger. For eksempel vil nogle kvinder med node-negativ brystkræft komme tilbage efter at være blevet behandlet med kirurgi alene. Genomisk test har vist sig at skelne mellem, hvilke knudenegative brystkræftpatienter der er mere tilbøjelige til at komme tilbage og derfor drage fordel af yderligere kemoterapi, og hvilke patienter der muligvis ikke har brug for kemoterapi.

for at forstå, hvordan videnskaben om genetik anvendes til diagnose og overvågning af kræft, er det nyttigt at have en forståelse af de grundlæggende principper for genetik. Dette inkluderer at vide, hvad DNA, kromosomer og gener er, hvordan de fungerer, og hvordan informationen indeholdt i DNA transformeres gennem genekspression til specifikke strukturer, der dikterer en celles funktioner.

med denne baggrundsviden er det muligt at forstå løftet om test til påvisning af genetiske abnormiteter, såsom:

• fluorescens in situ hybridisering (fisk)
• polymerasekædereaktion (PCR)
• revers transkription PCR
• Microarray technology
• Serum proteomics

baggrund—grundlæggende principper for Genetik

betydningen af genetik i arvelighed er velkendt; den rolle, som genetik spiller i styringen af cellernes struktur og funktion, kan dog være endnu mere kritisk for en individuel organisme. Arvelighed sikrer, at mennesker og alle arter er i stand til at reproducere og forevige deres unikke træk og styre, hvordan celler bygges, hvilket arbejde de udfører, og hvordan de vokser, er nødvendigt for at sikre, at en organisme overlever for at reproducere. En forståelse af denne kritiske rolle, som DNA og gener har i bestemmelsen af en celles minut for minut, er også vigtig for at forstå, hvordan genetik er involveret i kræft.

DNA: den genetiske information for en hel organisme er indeholdt i kernen i hver celle i form af deoksyribonukleinsyre, almindeligvis kendt som DNA. DNA er et dobbeltstrenget spiralformet (oprullet) molekyle. Hver streng er sammensat af en strukturel rygrad plus en sekvens af nitrogenholdige forbindelser kaldet nitrogenholdige baser, som kan betragtes som alfabetet for genetik. Der er fire baser: adenin, guanin, thymin og cytosin. De to tråde er forbundet ved baserne.

den genetiske kode eller den genetiske information, der styrer cellens struktur og funktion, er indeholdt i sekvensen af baser. Basissekvensen styrer til sidst sekvensen af aminosyrer, der er forbundet sammen for at fremstille et proteinmolekyle. Forskellige sekvenser gør forskellige proteiner. De proteiner, der syntetiseres i en celle, bestemmer strukturen og funktionen af den celle.

kromosomer: DNA pakkes i et specifikt antal enheder kaldet kromosomer. Mennesker har 46 kromosomer i hver celle. Det meste af tiden pakkes kromosomerne tæt omkring proteiner i cellens kerne, så de ikke kan ses. I stadierne af cellens liv lige før celledeling bliver kromosomerne imidlertid synlige med et lysmikroskop. De ser ud som en hovedstad ‘H’ med fire længder af oprullet DNA forbundet med et protein som “korset” af “H”.

gener: DNA er organiseret i gener, som er lange segmenter af DNA, der inkluderer regioner, der indeholder koder for proteiner kaldet eksoner, såvel som ikke-kodende regioner kaldet introner. Gener defineres som den grundlæggende enhed for arvelighed, fordi de overføres til afkom og derefter replikeres og overføres til individuelle celler under celledeling. Replikation indebærer at bruge begge DNA-strenge som skabeloner til at syntetisere gratis DNA (cDNA), som er en matchende streng. Resultatet er to identiske kopier af DNA for hver celle, efter at celledeling er afsluttet. Under normale forhold forbliver strukturen af DNA og dermed gener relativt konstant gennem replikation og celledeling.

genekspression: den genetiske information indeholdt i gener oversættes til cellulær struktur og funktion gennem en proces kaldet genekspression. Gener kan betragtes som koder eller opskrifter til fremstilling af proteiner. Proteiner er den grundlæggende komponent i cellestruktur og funktion. Når et gen er “udtrykt”, bliver proteinet eller proteinerne, som det koder for, aktivt bygget i cellen, og den funktion, som disse proteiner tjener, udføres. For eksempel, når HER-2/neu-genet udtrykkes i brystkræft, er der flere epidermale vækstfaktorreceptorer (EGFRs) til stede, som er proteiner på celleoverfladen, som HER-2/neu koder for. Desuden er EGFR ‘s funktion at stimulere cellevækst; så en celle, der udtrykker HER-2/neu, har mange EGFR’ er og vokser aktivt.

genekspression sker gennem et komplekst system, der involverer følgende trin:

• midlertidig adskillelse af de to tråde af DNA-molekylet ved et bestemt gen.
• transkription af segmentet af DNA, som er syntesen af en enkeltstrenget kopi af DNA-sekvensen, der er eksponeret; denne kopi kaldes messenger RNA (mRNA).
• proteinsyntese eller opbygning af nye proteiner i cellen baseret på oplysningerne i mRNA ‘ et.

genetiske abnormiteter: Genetiske abnormiteter er ændringer i DNA ‘ et i en celle, der kan forekomme tilfældigt eller på grund af en miljøpåvirkning. Disse ændringer giver den berørte celle en fordel i forhold til normale celler, der hjælper dem med at vokse. Som følge heraf er cellen i stand til at opdele hurtigt og blive en kræftvækst. Denne vækstfordel gavner imidlertid kun den enkelte celle og ikke nødvendigvis hele organismen (mennesket).

typer af genetiske abnormiteter omfatter:

translokationer-de skiftende steder af et gen fra et kromosom med et gen på et andet kromosom; denne type abnormitet definerer de mange forskellige leukæmier

sletninger—et gen eller en sekvens af nukleotider mangler i DNA ‘ et

polymorfier—variationer i nukleotidsekvens

test til påvisning af genetiske abnormiteter

en række nye laboratorietests kan detektere genetiske abnormiteter. At finde en sygdomsfremkaldende mutation i et gen kan bekræfte en mistænkt diagnose af kræft eller identificere dem, der er disponeret for visse kræftformer. Nogle af disse teknikker, der i øjeblikket anvendes i den kliniske indstilling, inkluderer:

• fluorescens in situ hybridisering (FISH)
• polymerasekædereaktion (PCR)
• revers transkription PCR

desuden anvendes følgende laboratorieteknikker i kræftforskning og kan være tilgængelige til klinisk brug i fremtiden:

• Microarray

fluorescens in situ hybridisering (fisk)

fisk er en laboratorieteknik, der bruges til at detektere genetiske abnormiteter på enkeltcelle-og enkeltgen-niveau, såsom numeriske abnormiteter (gevinster og tab af nukleotider) og translokationer (de skiftende steder for et gen eller et segment af gener på et kromosom med Gen eller et segment på et andet kromosom). Disse abnormiteter spiller en rolle i udviklingen og udviklingen af nogle kræftformer, såsom leukæmier og lymfomer1.

Hvordan fungerer fisk? Fisk udføres på prøveceller, hvis DNA er unraveled, så de enkelte kromosomer er synlige. Dette sker i cellefaser lige før celledeling, kaldet metafase eller interfase. Prøve-DNA ‘ et denatureres først ved hjælp af varme og det kemiske formamid, så de enkelte tråde adskilles og udsætter basissekvensen. Dernæst inkuberes eller kombineres specifikke DNA-sekvenser, kaldet prober, der er bundet til farvede fluoros, med prøve-DNA ‘ et. Proberne hybridiserer (forbinder) med DNA ‘ et i kromosomerne, der er komplimentet til basissekvensen i sonden. Tilstedeværelsen eller fraværet af fluorescens fra det hybridiserede DNA og sonde er synlige med et specialiseret mikroskop og indikerer, om DNA-sekvensen af interesse er til stede i prøven. Desuden kan specialiserede fisketeknikker bruges til at detektere translokationer, inversioner og amplifikationer, der er involveret i kræft.2

fisk i bryst-og æggestokkræft: en almindelig anvendelse, hvis fisk er at afgøre, om patienter med bryst-og æggestokkræft overudtrykker HER2/neu-onkogen, et gen, der ofte er involveret i kræft. HER2 / neu bærer den genetiske kode for HER2-receptoren, et protein på overfladen af nogle kræftceller. HER2 binder med vækstfaktorer i blodet og stimulerer dermed kræftceller til at vokse.

HER2/neu forstærkes i ca.20% til 30% af bryst-og ovariecancer, og denne amplifikation og/eller overekspression indikerer en dårlig prognose.3 fisk kan bruges til at observere, om HER2/neu-onkogen sender flere signaler på niveauet for de enkelte celler, hvilket indikerer genamplificering.

fisk i hæmatologiske (blod) kræftformer: Fisk kan også bruges til at diagnosticere og håndtere forskellige hæmatologiske maligniteter. Den genetiske abnormitet, der ligger til grund for mange hæmatologiske maligniteter, er kromosomal translokation eller de skiftende steder af gen fra et kromosom med et gen på et andet kromosom.

polymerasekædereaktion (PCR)

PCR er en in vitro laboratoriemetode, der er nyttig til genetisk testning for sygdom og påvisning af minimal restsygdom, som er en lille mængde sygdom tilbage efter behandling, der kan føre til gentagelse og typisk ikke kan påvises med andre teknikker. Denne procedure forstærker et segment af DNA fra en lille prøve, hvilket gør det detekterbart. Med PCR kan relativt små sekvenser af kendt DNA replikeres i millioner af kopier over en kort periode.

Hvordan virker PCR? Denne metode kræver fire principkomponenter: 1) prøve-DNA ‘ et, 2) en rigelig forsyning af nukleotider, 3) en varmestabil polymerase, der er ansvarlig for kopiering af DNA, og 4) primere, kort sekvens af nukleotider, der ligger på hver side af DNA-fragmentet af interesse og signalerer polymerasen for at begynde replikation af det specifikke DNA-segment.

PCR er en tre-trins proces, der hver forekommer ved en anden temperatur. Prøve-DNA ‘ et opvarmes først til ca.90 liter for at adskille de 2 parrede DNA-strenge. Når den er adskilt, afkøles den til en temperatur, der gør det muligt for primerne at hybridisere til deres komplementære sekvens på mål-DNA ‘ et, cirka 40 liter. Endelig forekommer DNA-replikation ved ca. 70 liter, den temperatur, ved hvilken DNA-polymerase er mest aktiv. Denne proces gentages 20 til 30 gange, hvilket resulterer i cirka 1 million gange amplifikation af DNA-fragmentet af interesse.4

revers transkription PCR

revers transkription (RT)-PCR er en teknik, der detekterer i hvilken grad gener udtrykkes. Komplicerede processer styrer, hvilket segment af DNA der adskilles, bliver transkriberet (kopieret) til mRNA og derefter udtrykt som proteiner i cellen. Ikke alle gener transkriberes og udtrykkes derefter ens. På grund af mange kontroller i cellen er nogle gener overudtrykt, hvilket betyder, at de transkriberes og udtrykkes med en højere hastighed end normalt, mens andre gener nu udtrykkes eller “slukkes”, så visse funktioner ikke manifesteres i cellen.

Hvordan virker RT-PCR? RT-PCR bruger de samme trin som PCR til at forstærke et segment af DNA, men prøven er en gratis kopi af mRNA. Ved at starte med mRNA måler denne test kun det DNA, der udtrykkes, hvilket gør det muligt at bestemme, i hvilken grad visse gener udtrykkes. Nylige anvendelser af RT-PCR i klinisk onkologi inkluderer påvisning af lymfeknude mikrometastaser i prostatacancer og knoglemetastaser i brystkræft.5

RT-PCR i brystkræft: brystkræfttesten Oncotype dksrent bruger RT-PCR til at bestemme den individuelle risiko for tilbagefald hos kvinder med node-negativ østrogenreceptor (er)-positiv brystkræft. Denne test evaluerer ekspression af 21 gener i brystkræft. Overekspression af nogle af disse gener indikerer en dårligere prognose, mens ekspression af andre kan indikere en bedre prognose. Ekspressionen af alle 21 gener bruges til at beregne en “Gentagelsesscore”, eller sandsynligheden for, at denne kræft vil gentage sig. Et stort klinisk forsøg viste, at Tilbagefaldsscore var mere effektiv til at forudsige prognose for kvinder med node-negativ, ER-positiv brystkræft end standardmål såsom patientens alder, kræftstørrelse og kræftstadium.6

strategier til forbedring af påvisning af genetiske abnormiteter

flere metoder til påvisning af genetiske abnormiteter anvendes til kræftforskning. Mens de endnu ikke rutinemæssigt anvendes i den kliniske indstilling, synes følgende at være lovende og kan bruges i fremtiden til diagnosticering, testning og overvågning af kræft.

Microarrays: Microarray-analyse er en teknik, der kombinerer biologi med datalogi for at generere en genetisk profil for en given vævsprøve, der afspejler aktiviteten af tusinder af gener. Denne teknologi har fordele i forhold til fisk eller PCR, fordi den i en enkelt analyse kan evaluere ekspressionen af alle de gener, der kan være involveret i en kræft, snarere end blot nogle få. Ved Grafisk at vise, hvordan alle generne er involveret i en kræft, kan mikroarrays generere en “genetisk signatur” for en bestemt kræft. Dette gør identifikationen af kræftsubtype mere præcis. Evnen til at tage et øjebliksbillede af en kræfts genetiske signatur kan føre til en bedre forståelse af, hvordan denne kræft udvikler sig, og hvordan man designer individualiseret behandling.

hvordan virker mikroarrays? Mens forskellige microarray metoder anvendes, hver består af fem grundlæggende trin:

• forberedelse af prøven
• kombination af prøven med computerchippen
• Scanning af computerchippen
• normalisering
• computeranalyse af resultaterne.

fremstilling af prøven: i det indledende trin syntetiseres cDNA fra RNA ved revers transkription (husk transkription involverer kopiering af DNA for at fremstille RNA, så revers transkription genererer DNA fra RNA) fra RNA, der er ekstraheret fra både en test og en referenceprøve. Prøve-DNA-segmenterne er mærket med fluorokromer eller radioaktive kemikalier, så de kan detekteres, når de kombineres med computerchippen.

kombination af prøven med computerchippen: dernæst kombineres prøven med computerchippen, som er et rektangulært gitter af pletter. Hvert sted har mange kopier af en bestemt DNA-sekvens. Disse sekvenser er afledt af offentlige databaser over DNA-sekvenser, der blev genereret gennem Human Genome Project, Den Videnskabelige bestræbelse, der identificerede stort set alle DNA-sekvenserne i den menneskelige art.

når prøven føjes til computerchippen, forekommer en proces kaldet hybridisering. Dette betyder, at prøve-DNA-segmentet binder (hybridiserer) til segmentet på computerchippen, der har den nøjagtige komplementære sekvens af nukleotider (de fire forbindelser, der er alfabetet for genetik).

Scanning af computerchippen: når hybridiseringen er afsluttet, bruges scannere til at detektere fluorescensen og skabe et digitalt billede, der afspejler, hvor prøve-DNA ‘ et kombineres med pletter på mikroarray-chippen.

normalisering: Da rå signalintensiteter kan variere mellem individuelle chips fra mange patienter eller eksperimenter, skal individuel chipintensitet justeres til en fælles standard eller normaliseres. For eksempel er subtraktion af baggrundsstøj en almindelig normaliseringsmetode, der anvendes på alle prøver. Normalisering gør det muligt at sammenligne genekspressionsprofiler fra mange patienter eller eksperimenter.

computeranalyse: det sidste trin i et microarray-eksperiment er computeranalyse. De tusinder af rådatapunkter, der er resultatet af mikroarray-analyser, er i det væsentlige uforståelige, medmindre de evalueres i sammenhæng med andre resultater. For eksempel kan genekspressionsprofilen (mikroarray-resultater) af normalt og sygt væv sammenlignes for at identificere gener, der varierer i deres ekspression og også identificere et mønster (profil), der kan indikere en særskilt klasse eller sygdomsstadium.7

mikroarrays i onkologi: Mikroarray-analyse har bidraget til onkologi ved at øge forståelsen af det genetiske grundlag for flere typer kræft, herunder B-celle ikke-Hodgkins lymfom (BCNHL), akut leukæmi og brystkræft.

• der er opnået betydelig viden om BCNHLS patologi ved at sammenligne genekspressionsmønstre for sygt og normalt væv. To forskellige sygdomskategorier viser forskellige genekspressionsprofiler. Microarrays har hjulpet med at etablere disse udtryksprofiler, og i fremtiden kan de hjælpe med at klassificere nye tilfælde af BCNHL nøjagtigt.
• i tilfælde af akut leukæmi har mikroarrays hjulpet med at etablere forskellige genekspressionsmønstre, der har hjulpet med at differentiere akut lymfocytisk leukæmi (ALL) og akut myeloid leukæmi (AML). Ved hjælp af disse profiler blev 29 ud af 34 nye tilfælde af leukæmi korrekt forudsagt.
• desuden har mikroarrays hjulpet med at identificere to forskellige genekspressionsprofiler i brystkræft, BCRA1 og BCRA2. Dette fund antyder forskellige måder, hvorpå brystkræft udvikler sig og giver spor, der fremmer yderligere forståelse af årsagen til brystkræft.7

1 Spagnolo SD, Ellis DV, Juneja S, Leong AS, et al. Molekylære undersøgelsers rolle i lymfomdiagnose: en gennemgang. Patologi 2004; 36 (1) 19-44.

2 Spurbeck JL, Adams SA, Stupca PJ, Duvald GV. Primer på medicinsk genomisk del: visualisering af menneskelige kromosomer. Mayo Clinic Proceedings 2004: 79: 58-75.

3 Paik S, Fisher ER, et al. Patologiske fund fra Det Nationale kirurgiske adjuverende bryst-og tarmprojekt: prognostisk betydning af ERB B-2-proteinoverekspression i primær brystkræft. J Clin Oncol 1990; 8: 103-112.

4 Tefferi A, et al. Primer på medicinsk genomik Del II: Baggrundsprincipper og metoder inden for Molekylær Genetik. Mayo Clinic Proceedings 2002; 77: 785-808.

5 Tefferi A, et al. Primer på medicinsk genomik Del II: Baggrundsprincipper og metoder inden for Molekylær Genetik. Mayo Clinic Proceedings 2002; 77: 785-808.

6 Paik s, Shak s, Tang G, et al. Multi-gen PT-PCR-analyse til forudsigelse af gentagelse hos node—negative brystkræftpatienter-nsabp-studier B-20 og B-14. Proc af det 26. årlige San Antonio Breast Cancer Symposium. 3.-8. December 2003; San Antonio, Abstract # 16.

7 Tefferi a, Bolander ME, Ansell SM, et al. Primer på medicinsk genomik Del III: mikroarray eksperimenter og dataanalyse. Mayo Clinic Processings2002; 77: 927-940.