G418

G418 (Geneticin, Invitrogen): opløs i vand ved 200 mg/ml, filtrer steriliser og opbevar i alikvoter ved 4 liter C.

clonNAT (nourseothricin, Viner BioAgents, Jena, Tyskland): opløs i vand ved 100 mg/ml, filtrer steriliser og opbevar i alikvoter ved 4 liter C.

Canavanin (L-Canavaninsulfatsalt, Sigma, C-9758): opløses i vand ved 100 mg / ml, filtrer steriliseres og opbevares i portioner ved 4 liter C.

thialysin(s-(2-aminoethyl)-L-Cysteinhydrochlorid, Sigma, a-2636): Dissolve in water at 100 mg/ml, filter sterilize, and store in aliquots at 4 °C.

Amino acids supplement powder mixture for synthetic media (complete): Contains 3 g adenine (Sigma), 2 g uracil (ICN), 2 g inositol, 0.2 g para-aminobenzoic acid (Acros Organics), 2 g alanine, 2 g arginine, 2 g asparagine, 2 g aspartic acid, 2 g cysteine, 2 g glutamic acid, 2 g glutamine, 2 g glycine, 2 g histidine, 2 g isoleucine, 10 g leucine, 2 g lysine, 2 g methionine, 2 g phenylalanine, 2 g proline, 2 g serine, 2 g threonine, 2 g tryptophan, 2 g tyrosine, and 2 g valine (Fisher). Drop-out (DO) pulverblanding er en kombination af ovennævnte ingredienser minus det passende supplement. To gram af Do-pulverblandingen anvendes pr.

aminosyretilskud til sporulationsmedium: indeholder 2 g histidin, 10 g leucin, 2 g lysin, 2 g uracil; 0,1 g af aminosyretilskudspulverblandingen anvendes pr.liter sporulationsmedium.

Glucose (Glucose, Fisher): tilbered 40% opløsning, autoklave og opbevar ved stuetemperatur.

YEPD: Tilsæt 120 mg adenin (Sigma), 10 g gærekstrakt, 20 g pepton, 20 g bacto agar (BD Difco) til 950 ml vand i en 2 l kolbe. Efter autoklavering tilsættes 50 ml 40% glucoseopløsning, blandes grundigt, afkøles til ~ 65 liter C og hæld plader.

YEPD + G418: Cool YEPD medium til ~ 65 liter C, tilsæt 1 ml G418 stamopløsning (slutkoncentration 200 mg/l), bland grundigt og hæld plader.

YEPD + clonNAT: Cool YEPD medium til ~ 65 liter C, tilsæt 1 ml clonNAT stamopløsning (slutkoncentration 100 mg/l), bland grundigt og hæld plader.

YEPD + G418 / clonNAT: Cool YEPD medium til ~ 65 liter C, tilsæt 1 ml G418 (slutkoncentration 200 mg/l) og 1 ml clonNAT (slutkoncentration 100 mg/l) stamopløsninger, bland grundigt og hæld plader.

beriget sporulation: tilsæt 10 g kaliumacetat (Fisher), 1 g gærekstrakt, 0,5 g glucose, 0,1 g aminosyrer supplement pulverblanding til sporulation, 20 g bacto agar til 1 l vand i en 2 l kolbe. Efter autoklavering afkøles medium til ~ 65 liter C, tilsættes 250 liter G418 stamopløsning (slutkoncentration 50 mg/l), blandes grundigt og hældes plader.

(SD/MSG) − His/Arg/Lys + canavanin/thialysin/G418: tilsæt 1,7 g gærnitrogenbase uden aminosyrer eller ammoniumsulfat (Bd Difco), 1 g MSG (L-glutaminsyre natriumsalthydrat, Sigma), 2 g aminosyrer supplement pulverblanding (DO − His/Arg/Lys), 100 ml vand i en 250 ml kolbe. Tilsæt 20 g bacto agar til 850 ml vand i en 2 l kolbe. Autoklave separat. Kombiner autoklaverede opløsninger, tilsæt 50 ml 40% glukose, køligt medium til ~ 65 liter C, tilsæt 0,5 ml canavanin (50 mg/l), 0,5 ml thialysin (50 mg/l) og 1 ml G418 (200 mg/l) stamopløsninger, bland grundigt og hæld plader. Ammoniumsulfat hæmmer funktionen af G418 og clonNAT. Derfor fremstilles syntetisk medium indeholdende disse antibiotika med mononatriumglutaminsyre som en nitrogenkilde (Cheng et al., 2000).

(SD/MSG) − His/Arg/Lys + canavanin/thialysin/clonNAT: tilsæt 1,7 g gærnitrogenbase uden aminosyrer eller ammoniumsulfat, 1 g MSG, 2 g aminosyrer supplement pulverblanding (DO − His/Arg/Lys), 100 ml vand i en 250 ml kolbe. Tilsæt 20 g bacto agar til 850 ml vand i en 2 l kolbe. Autoklave separat. Kombiner autoklaverede opløsninger, tilsæt 50 ml 40% glukose, køligt medium til ~ 65 liter C, tilsæt 0.5 ml canavanin (50 mg/l), 0,5 ml thialysin (50 mg/l) og 1 ml clonNAT (100 mg/l) stamopløsninger blandes grundigt og hældes i plader.

(SD/MSG) − His/Arg/Lys + canavanin/thialysin/G418/clonNAT: tilsæt 1,7 g gærnitrogenbase uden aminosyrer eller ammoniumsulfat, 1 g MSG, 2 g aminosyrer supplement pulverblanding (DO − His/Arg/Lys), 100 ml vand i en 250 ml kolbe. Tilsæt 20 g bacto agar til 850 ml vand i en 2 l kolbe. Autoklave separat. Kombiner autoklaverede opløsninger, tilsæt 50 ml 40% glucose, køligt medium til ~ 65 liter C, tilsæt 0,5 ml Canavanin (50 mg/l), 0.5 ml thialysin (50 mg/l), 1 ml G418 (200 mg/l) og 1 ml clonNAT (100 mg/l) stamopløsninger blandes grundigt og hældes i plader.

(SD/MSG) komplet: tilsæt 1,7 g gærnitrogenbase uden aminosyrer eller ammoniumsulfat, 1 g MSG, 2 g aminosyrer supplement pulverblanding (komplet), 100 ml vand i en 250 ml kolbe. Tilsæt 20 g bacto agar til 850 ml vand i en 2 l kolbe. Autoklave separat. Kombiner autoklaverede opløsninger, tilsæt 50 ml 40% glucose, bland grundigt, køligt medium til ~ 65 liter C og hæld plader.

SD − His/Arg/Lys + canavanin/thialysin: Tilføj 6.7 g gærnitrogenbase uden aminosyrer (Bd Difco), 2 g aminosyrer supplerer pulverblanding (DO − His/Arg/Lys), 100 ml vand i en 250 ml kolbe. Tilsæt 20 g bacto agar til 850 ml vand i en 2 l kolbe. Autoklave separat. Kombiner autoklaverede opløsninger, tilsæt 50 ml 40% glukose, køligt medium til ~ 65 liter C, tilsæt 0,5 ml canavanin (50 mg/l) og 0,5 ml thialysin (50 mg/l) stamopløsninger, bland grundigt og hæld plader. Dette medium indeholder ikke antibiotika såsom G418 eller clonNAT, og derfor anvendes ammoniumsulfat som nitrogenkilde.

SD − Leu/Arg/Lys + canavanin/thialysin: tilsæt 6,7 g gærnitrogenbase uden aminosyrer, 2 g aminosyrertilskudspulverblanding (DO − Leu/Arg/Lys), 100 ml vand i en 250 ml kolbe. Tilsæt 20 g bacto agar til 850 ml vand i en 2 l kolbe. Autoklave separat. Kombiner autoklaverede opløsninger, tilsæt 50 ml 40% glukose, køligt medium til ~ 65 liter C, tilsæt 0,5 ml canavanin (50 mg/l) og 0,5 ml thialysin (50 mg/l) stamopløsninger, bland grundigt og hæld plader.