Giemsa-plet: princip, Procedure og resultater

Giemsa-plet er en type Romanovsky-plet, opkaldt efter Gustav Giemsa, en tysk kemiker, der skabte en farvestofopløsning. Det var primært designet til demonstration af malariaparasitter i blodudstrygning, men det anvendes også i histologi til rutinemæssig undersøgelse af blodudstrygning.

anvendelser af Giemsa-plet

bortset fra farvning af malariaparasitter har Giemsa-plet en række anvendelser inden for Mikrobiologi og patologi:

• Giemsa-plet bruges til at opnå forskellige hvide blodlegemer.
• det bruges også til at differentiere nuklear og cytoplasmatisk morfologi af de forskellige blodlegemer som blodplader, RBC ‘er, VBC’ er.
• i mikrobiologi anvendes Giemsa-plet til farvning af inklusionslegemer i Chlamydia trachomatis, Borrelia-arter, og hvis der ikke er nogen plet til farvning af Yersinia pestis. Giemsa plet også bruges til at plette Histoplasma capsulatum, Pneumocystis jiroveci, Klebsiella granulomatis, Penicillium marneffei og lejlighedsvis bakterielle kapsler.
• denne plet bruges også i cytogenetik til at plette kromosomerne og identificere kromosomafvigelser. Det er almindeligt anvendt til G-banding (Giemsa-Banding)

princippet om Giemsa-plet

Giemsa-plet er en differentieret plet og indeholder en blanding af blåt, methylenblåt og eosin-farvestof. Det er specifikt for fosfatgrupperne af DNA og binder sig til, hvor der er store mængder adenin-thyminbinding.

blå og eosin er surt farvestof, som variabelt pletter de grundlæggende komponenter i cellerne som cytoplasma, granulat osv.

methylenblåt fungerer som det basiske farvestof, der pletter de sure komponenter, især cellens kerne.

Methanol fungerer som et fikseringsmiddel såvel som den cellulære plet. Fikseringsmidlet tillader ikke yderligere ændringer i cellerne og får dem til at klæbe til glasglasset.

sammensætning af Giemsa-plet

Giemsa-plet kan fremstilles i huset ved hjælp af Giemsa-pletpulver eller kan fås kommercielt. De grundlæggende ingredienser i begge er de samme; fortyndinger kan dog foretages afhængigt af brugen.

PROCEDURE

A. til intern forberedelse af plet:

1. væg den nødvendige mængde pulverfarve, og overfør den til en ren, tør flaske med 1 liter kapacitet. Tilsæt methanol og bland godt.
2. mål og tilsæt glycerol og bland godt.
3. anbring flasken plet i vandbad ved 50-60 liter C eller ved 37 liter C i op til 2 timer med hyppig blanding.
4. Mærk flasken og opbevar den på et køligt, mørkt sted med en fast prop.

BEMÆRK: Hvis vand kommer i kontakt under nogen trin til klargøring af pletten, pletten bliver forkælet, brug derfor, tør glasvarer og opbevar under forhold, hvor der ikke ville være vandkontakt.

• 1 og fortynd med vand bufret til pH 7,2 for at lave arbejdsløsninger

B. Til farvningsglas

metoden til farvning, koncentration og timing af den anvendte plet varierer alt efter formålet, for eksempel bruger tynde blodudstrygninger 1:20 fortynding af lager, mens der for tykt blodudstrygning anvendes 1:50 fortynding.

fortynd blodudstrygning

1. fastgør lufttørret film i absolut methanol ved at dyppe filmen kort (to dips) i en Coplin-krukke indeholdende absolut methanol.
2. Fjern og lad luften tørre.
3. plet med fortyndet Giemsa plet (1:20, vol/vol) i 20 min (for en 1:20 fortynding, tilsæt 2 ml lager Giemsa til 40 ml bufret vand i en Coplin-krukke).
4. vask ved kort at dyppe objektglasset ind og ud af en Koplinkrukke med bufret vand (en eller to dips).
   Bemærk: overdreven vask vil affarve filmen.
5. lad lufttørre lodret. Observere under mikroskopet først ved 40 gange og derefter bruge olie nedsænkning linse

Fortyk blod udstrygninger

1. lad filmen lufttørre grundigt i flere timer eller natten over. Tør ikke film i en inkubator eller ved varme, fordi dette vil fikse blodet og forstyrre lyseringen af RBC ‘ erne.
   Bemærk: Hvis der er behov for en hurtig diagnose af malaria, kan tykke film laves lidt tyndere end normalt, får lov til at tørre i 1 time og derefter farves.
2. LØS IKKE.
3. plet med fortyndet Giemsa-plet (1:50, vol/vol) i 50 minutter (til en fortynding på 1:50 tilsættes 1 ml lager Giemsa til 50 ml bufret vand i en Coplin-krukke)
4. vask ved at placere filmen i bufret vand i 3 til 5 minutter.
5. lad lufttørre i lodret position og observer først under mikroskopet ved 40 gange og derefter ved hjælp af oliedypningslinse

for Chlamydia trachomatis

Følg ovennævnte trin, men med den fortyndede plet på 1:40 fortynding (tilsæt 0,5 ml lager Giemsa-opløsning til 19,5 ml bufret vand) og lad pletten stå i 90-120 minutter.

OBSERVATION:

på mikroskopisk observation skelnes celleorganeller, bakterier og parasitter ud fra deres morfologi og farve;