10.4.2 Trehalose til kryopræservering af pattedyrceller
kryopræservering har været almindeligt anvendt til konservering af celler over længere perioder ved ekstremt lave temperaturer. Imidlertid kan fysiske ændringer, der opstår under frysning og optøning, være skadelige for celleoverlevelse og funktioner. Derfor skal kryobeskyttelsesmidler tilsættes til cellerne under kryopræservering. Anvendelsen af trehalose som kryobeskyttelsesmiddel for celler fremgik af forestillingen om, at der kræves polyhydroksiforbindelser på begge sider af cellemembranen for at cellerne kan bevares i længere perioder . Trehalose er blevet undersøgt af flere grupper som et beskyttelsesmiddel til kryokonservering af forskellige humane celler.
Beattie et al. introduceret trehalose sammen med DMSO i pancreas Langerhans celler ved hjælp af termotropisk væskefaseovergang . Kryopræservering med trehalose resulterede i 92% genopretning af voksne holme sammenlignet med kun 58% genopretning ved hjælp af DMSO alene. Fjorten gange mere insulin blev fundet i transplantaterne fra Holme kryokonserveret med trehalose end dem uden trehalose. Gendannelsen af humane føtale ølignende celleklynger (ICC ‘ er) kryokonserveret med trehalose var 94% sammenlignet med kun 42% for dem uden trehalose. Ved transplantation i nøgne mus blev der observeret en 15 gange stigning i insulinindholdet i transplantater fra ICC-kryokonserveret med trehalose. Disse resultater indikerer, at tilsætningen af trehalose som kryopræservant fører til meget høje overlevelsesrater for humant pankreatisk endokrin væv.
Toner og kolleger introducerede lave koncentrationer af trehalose i pattedyrceller ved hjælp af en genetisk konstrueret version af det poredannende protein alfa-hemolysin og fandt ud af, at intracellulær trehalose i høj grad kan forbedre overlevelsen af disse celler under kryopræservering . Langvarige overlevelsesrater efter optøning af kryokonserverede musefibroblaster og humane keratinocytter var henholdsvis 80% og 70% ved en intracellulær trehalosekoncentration på 0,2 M. Intracellulær trehalose viste sig også at have en gavnlig virkning på membranintegriteten af tørrede pattedyrceller, med mere end 90% genvinding af intakt plasmamembran observeret ved tørring og opbevaring af cellerne under milde betingelser i flere uger .
virkningen af trehalose på kryopræservering af humane hepatocytter blev undersøgt af Katents et al. . Leverceller frosset i dyrkningsmedium med 10% DMSO og 0,2 M trehalose viste signifikant forbedring i cellens levedygtighed og pletteringseffektivitet efter optøning sammenlignet med DMSO alene. Tilstedeværelsen af trehalose under kryopræservering resulterede også i øget totalt proteinniveau i de vedhæftede celler, højere albuminsekretionsniveauer og lavere aspartataminotransferaseniveauer efter optøning.
stamceller er vigtige redskaber til undersøgelse af hæmatopoiesis, udvikling af nye terapeutiske strategier samt modelsystemer til visse sygdomme. På trods af udviklingen i kryokonservering er celledød efter optøning fortsat et stort problem. Martinetti et al. brugt trehalose til cryopreserve ren hæmatopoietisk stamme og stamceller fra perifert blod for at forhindre celletab, der opstår under normal kryopreservering . Ekspressionen af overfladestammarkøren CD34 blev evalueret, og 1 M trehalose viste sig at give forbedret kryobeskyttelse til CD34+ celler med højere celletal og cellelevedygtighed sammenlignet med standardfrysningsmetoden ved anvendelse af DMSO. Desuden bevarede kryopræservering med trehalose i kortere og længere perioder CD34+ – cellernes evne til at differentiere til megakaryopoietiske celler efter optøning. Disse resultater antyder trehaloses evne til at bevare stamcellernes levedygtighed og funktioner, når de anvendes som kryobeskyttelsesmiddel.
langtidsopbevaring af røde blodlegemer (RBC ‘ er) og blodplader, samtidig med at der opretholdes en høj grad af levedygtighed, har vigtige konsekvenser i blodtransfusion og klinisk medicin. Satpathy et al. beskrevet en metode til indlæsning af RBC ‘ er med trehalose fra et ekstracellulært medium under anvendelse af osmotisk ubalance og phospholipidfaseovergang, der resulterede i intracellulære trehalosekoncentrationer på 40 mM . Trehalose viste sig at udøve osmotisk beskyttelse af RBC ‘ erne i længere perioder. Frysetørring af de trehalosebelastede RBC ‘ er efterfulgt af rehydrering resulterede i 55% overlevelse med tilbageholdelse af deres morfologi. De overlevende celler syntetiserede ATP og 2,3-diphosphoglycerat (DPG) og havde lave niveauer af methemoglobin. Aktiviteten af SOD og catalase og den sekundære struktur af hæmoglobin i de frysetørrede RBC ‘er var alle meget lig dem af friske RBC’ er. Denne undersøgelse viste, at trehalosebelastning var nødvendig for stabilisering af hæmoglobin og gav et vigtigt skridt mod kryokonservering af RBC ‘ er.
den normale opbevaringstid for humane blodplader i blodbanker er 5 dage, hvorefter de kasseres, hvilket resulterer i kronisk mangel på blodplader, der kræves til transfusion. Som et forsøg på kryopræservering af blodplader i længere perioder, Ulvere et al. beskrevet en metode til indføring af trehalose i cytoplasmaet af humane blodplader . Trehalose viste sig let at blive opfanget af de humane blodplader ved 37 kg C med en belastningseffektivitet på mere end 50%. Frysetørring og rehydrering af de trehalosebelastede blodplader resulterede i fremragende genopretning af intakte blodplader med overlevelsesrate på 85%. Disse blodplader reagerede på en næsten identisk måde med friske blodplader mod agonister, såsom thrombin, ADP, kollagen og ristocetin. Membranmikrodomænerne og proteinkomponenterne i trehalosebelastede blodplader blev opretholdt intakte efter frysetørring og rehydrering.
den beskyttende virkning af trehalose blev også påvist i dessikerede hornhindeepitelceller. Præinkubering af dyrkede hornhindeepitelceller med trehalose efterfulgt af tørring resulterede i signifikant reduktion i procentdelen af døde celler sammenlignet med kontrolmediet . Den beskyttende virkning blev også bekræftet tidligere i enucleated porcine eyes, hvor vævet inkuberet med trehalose var synligt glattere . Disse resultater indikerer nytten af trehalose i oftalmologi og dens potentielle anvendelse som et øjendråbe til tørt øjesyndrom.
anvendelsen af trehalose til kryopræservering af organeller er blevet demonstreret af Yamaguchi et al., der brugte trehalose som kryobeskyttelsesmiddel til frosne mitokondrier . Mitokondrier frosset i nærvær af trehalose udviste mitokondrie ydre membran (MOM) integritet og lydhørhed over for Bcl-2 familieproteiner svarende til dem fra friske mitokondrier. Ultrastrukturen, ATP-syntese, transmembranpotentiale, calciuminduceret hævelse og import og behandling af precursorproteiner blev også bevaret i nærvær af trehalose. Dette er i modsætning til den standard saccharose-mannitolbuffer, der anvendes til frysning af mitokondrier, der ofte bliver utætte. Trehalose var således i stand til at bevare de fleste af de biologiske træk ved mitokondrier og trehalose-frosne mitokondrier kan bruges til forskning i apoptose og andre mitokondrielle funktioner, der er afhængige af MOM-integritet.
Trehalose er blevet brugt til konservering af organer over længere perioder. En” et-Kyoto-løsning ” blev udviklet af Vadas gruppe til konservering af hundelunge i >30 timer uden at påvirke ydeevnen af endotelceller og vaskulatur . Langvarig stabilisering og konservering af vacciner og antistoffer er også opnået ved anvendelse af trehalose.
