Metoder til Proteinrensning: 4 metoder

denne artikel kaster lys over de fire metoder til proteinrensning.

de fire metoder til proteinrensning er: (1) ekstraktion (2) udfældning og Differentialopløseliggørelse (3)ultracentrifugering og (4) kromatografiske metoder.

de metoder, der anvendes til proteinrensning, kan groft opdeles i analytiske og præparative metoder.

sondringen er ikke nøjagtig, men den afgørende faktor er mængden af protein, der praktisk talt kan renses med denne metode. Analysemetoder sigter mod at detektere og identificere et protein i en blanding, mens præparative metoder sigter mod at producere store mængder af proteinet til andre formål, såsom strukturel biologi eller industriel anvendelse. Generelt kan de præparative metoder anvendes i analytiske applikationer, men ikke omvendt.

Metode # 1. Udvinding:

afhængigt af kilden skal proteinet bringes i opløsning ved at bryde vævet eller cellerne, der indeholder det. Der er flere metoder til at opnå dette; gentagen frysning og optøning, sonikering, homogenisering ved højt tryk eller permeabilisering af organiske opløsningsmidler. Den valgte metode afhænger af, hvor skrøbeligt proteinet er, og hvor robust cellerne er.

efter denne ekstraktionsproces vil opløseligt protein være i opløsningsmidlet og kan adskilles fra cellemembraner, DNA osv. ved centrifugering. Ekstraktionsprocessen ekstraherer også proteaser, som begynder at fordøje proteinerne i opløsningen. Hvis proteinet er følsomt over for proteolyse, er det normalt ønskeligt at fortsætte hurtigt og holde ekstraktet afkølet for at bremse proteolysen.

Metode # 2. Udfældning og Differentialopløseliggørelse:

ved oprensning af bulkprotein er et almindeligt første skridt til at isolere proteiner udfældning med ammoniumsulfat (NH4)2so4. Dette udføres ved at tilsætte stigende mængder ammoniumsulfat og opsamle de forskellige fraktioner af bundfaldsprotein. En fordel ved denne metode er, at den kan udføres billigt med meget store mængder.

de første proteiner, der skal renses, er vandopløselige proteiner. Oprensning af integrerede membranproteiner kræver forstyrrelse af cellemembranen for at isolere et bestemt protein fra andre, der er i det samme membranrum. Nogle gange kan en bestemt membran trækkraft isoleres først, såsom isolering af mitokondrier fra celler før rensning af et protein placeret i en mitokondriel membran.

et vaskemiddel såsom natriumdodecylsulfat (SDS) kan bruges til at opløse cellemembraner og holde membranproteiner i opløsning under oprensning; men fordi SDS forårsager denaturering, kan mildere vaskemidler såsom Triton H-100 eller CHAPS bruges til at bevare proteinets native konformation under oprensning.

metode # 3. Ultracentrifugering:

centrifugering er en proces, der bruger centrifugalkraft til at adskille blandinger af partikler med forskellige masser eller densiteter suspenderet i en væske. Når en beholder (typisk et rør eller en flaske) indeholdende en blanding af proteiner eller andre partikler, såsom bakterieceller, roteres ved høje hastigheder, giver vinkelmomentet en udadgående kraft til hver partikel, der er proportional med dens masse.

tendensen af en given partikel til at bevæge sig gennem væsken på grund af denne kraft opvejes af modstanden væsken udøver på partiklen. Nettoeffekten af at” spinde “prøven i en centrifuge er, at massive, små og tætte partikler bevæger sig udad hurtigere end mindre massive partikler eller partikler med mere” træk ” i væsken.

når suspensioner af partikler “spindes” i en centrifuge, kan der dannes en “pellet” i bunden af beholderen, der er beriget for de mest massive partikler med lav træk i væsken. De resterende, ikke-komprimerede partikler, der stadig forbliver mest i væsken, kaldes “supernatanten” og kan fjernes fra beholderen for at adskille supernatanten fra pelleten.

centrifugeringshastigheden specificeres ved den Vinkelacceleration, der påføres prøven, typisk målt i sammenligning med g. hvis prøverne centrifugeres længe nok, vil partiklerne i beholderen nå ligevægt, hvor partiklerne akkumuleres specifikt på et punkt i beholderen, hvor deres opdrift densitet er afbalanceret med centrifugalkraft. En sådan” ligevægt ” centrifugering kan tillade omfattende oprensning af en given partikel.

saccharosegradientcentrifugering:

en lineær koncentrationsgradient af sukker (typisk saccharose glycerol eller Percoll) genereres i et rør, således at den højeste koncentration er på bunden og lavest på toppen. En proteinprøve lagdes derefter oven på gradienten og spindes ved høje hastigheder i en ultracentrifuge. Dette får tunge makromolekyler til at migrere mod bunden af røret hurtigere end lettere materiale.

under centrifugering i fravær af saccharose, når partikler bevæger sig længere og længere fra rotationscentret, oplever de mere og mere centrifugalkraft (jo længere de bevæger sig, jo hurtigere bevæger de sig). Problemet med dette er, at det nyttige adskillelsesområde i fartøjet er begrænset til et lille observerbart vindue.

Spinning En prøve dobbelt så lang betyder ikke, at partiklen af interesse vil gå dobbelt så langt; faktisk vil det gå betydeligt længere. Men når proteinerne bevæger sig gennem en saccharosegradient, støder de på væske med stigende densitet og viskositet.

en korrekt designet saccharosegradient modvirker den stigende centrifugalkraft, så partiklerne bevæger sig i tæt forhold til den tid, de har været i centrifugalfeltet. Prøver adskilt af disse gradienter betegnes som “hastighedsregulerede” centrifugeringer. Efter adskillelse af proteinet / partiklerne fraktioneres gradienten derefter og opsamles.

Metode # 4. Kromatografiske metoder:

normalt indeholder en proteinrensningsprotokol et eller flere kromatografiske trin. Den grundlæggende procedure i kromatografi er at strømme opløsningen indeholdende proteinet gennem en søjle pakket med forskellige materialer. Forskellige proteiner interagerer forskelligt med søjlematerialet og kan således adskilles med den tid, der kræves for at passere søjlen, eller de betingelser, der kræves for at eluere proteinet fra søjlen. Normalt påvises proteiner, når de kommer ud af søjlen ved deres absorbans ved 280 nm.

der findes mange forskellige kromatografiske metoder:

1. Kromatografi i størrelse:

kromatografi kan bruges til at adskille protein i opløsning eller denatureringsbetingelser ved hjælp af porøse geler. Denne teknik er kendt som størrelse udelukkelse kromatografi. Princippet er, at mindre molekyler skal krydse et større volumen i en porøs matrice. Følgelig vil proteiner med et bestemt interval i størrelse kræve et variabelt volumen eluant (opløsningsmiddel), inden de opsamles i den anden ende af gelkolonnen.

i forbindelse med proteinrensning samles eluanten normalt i forskellige reagensglas. Alle reagensglas, der ikke indeholder noget målbart spor af proteinet, der skal renses, kasseres. Den resterende opløsning er således lavet af proteinet til rensning og andre proteiner af samme størrelse.

2. Ionbytningskromatografi:

ionbytningskromatografi adskiller forbindelser i henhold til arten og graden af deres ioniske ladning. Den kolonne, der skal bruges, vælges efter dens type og ladningsstyrke. Anionbytterharpikser har en positiv ladning og bruges til at tilbageholde og adskille negativt ladede com-pund, mens kationbytterharpikser har en negativ ladning og bruges til at adskille positivt ladede molekyler.

før adskillelsen begynder, pumpes en buffer gennem søjlen for at ækvilibrere de modstående ladede ioner. Efter injektion af prøven udveksles opløste molekyler med bufferionerne, da hver konkurrerer om bindingsstederne på harpiksen. Længden af tilbageholdelsen for hvert opløst stof afhænger af styrken af dets ladning.

de svageste ladede forbindelser eluerer først efterfulgt af dem med successivt stærkere ladninger. På grund af adskillelsesmekanismens art spiller pH, buffertype, bufferkoncentration og temperatur alle vigtige roller i styringen af adskillelsen. Ionbytningskromatografi er et meget kraftfuldt værktøj til brug i proteinrensning og bruges ofte i både analytiske og præparative separationer.

3. Affinitetskromatografi:

affinitetskromatografi er en separationsteknik baseret på molekylær konformation, som ofte anvender applikationsspecifikke harpikser. Disse harpikser har ligander fastgjort til deres overflader, som er specifikke for forbindelserne, der skal adskilles. Oftest fungerer disse ligander på en måde, der ligner den for antistof-antigen-interaktioner. Denne” lås og nøgle ” passer mellem liganden og dens målforbindelse gør den meget specifik og genererer ofte en enkelt top, mens alt andet i prøven ikke bevares.

mange membranproteiner er glycoproteiner og kan renses ved lectinaffinitetskromatografi. Detergentopløselige proteiner kan få lov til at binde til en kromatografiharpiks, der er blevet modificeret til at have et kovalent bundet lectin.

proteiner, der ikke binder til lektinet, vaskes væk, og derefter kan specifikt bundne glycoproteiner elueres ved at tilsætte en høj koncentration af et sukker, der konkurrerer med de bundne glycoproteiner på lektinbindingsstedet. Nogle lectiner har høj affinitetsbinding til oligosaccharider af glycoproteiner, der er svære at konkurrere med sukkerarter, og bundne glycoproteiner skal frigives ved denaturering af lectinet.

4. Metalbinding:

en almindelig teknik involverer konstruktion af en sekvens på 6 til 8 histidiner i proteinets C-terminal. Polyhistidin binder stærkt til divalente metalioner såsom nikkel og kobolt. Proteinet kan føres gennem en søjle indeholdende immobiliserede nikkelioner, som binder polyhistidinmærket. Alle ikke-taggede proteiner passerer gennem søjlen.

proteinet kan elueres med polyhistidin-mærket for binding til søjlen eller ved et fald i pH (typisk til 4,5), hvilket nedsætter affiniteten af mærket for harpiksen. Mens denne procedure generelt anvendes til oprensning af rekombinante proteiner med en konstrueret affinitetsmærke (såsom en 6his-tag eller Clontechs HATMÆRKE), kan den også bruges til naturlige proteiner med en iboende affinitet tor divalente kationer.

5. Immunoaffinitetskromatografi:

Immunoaffinitetskromatografi bruger den specifikke binding af et antistof til målproteinet til selektivt at rense proteinet. Proceduren involverer immobilisering af et antistof mod et søjlemateriale, som derefter selektivt binder proteinet, mens alt andet strømmer igennem. Proteinet kan ek elueres ved at ændre pH eller saltholdigheden. Da denne metode ikke involverer teknik i et tag, kan den bruges til proteiner fra naturlige kilder.

6. HPLC:

højtydende væskekromatografi eller højtryksvæskekromatografi er en form for kromatografi, der anvender højt tryk for at drive de opløste stoffer hurtigere gennem søjlen. Dette betyder, at diffusionen er begrænset, og opløsningen forbedres. Den mest almindelige form er” omvendt fase ” HPLC, hvor søjlematerialet er hydrofobt.

proteinerne elueres ved en gradient af stigende mængder af et organisk opløsningsmiddel, såsom acetonitril. Proteinerne eluerer i henhold til deres hydrofobicitet. Efter oprensning med HPLC er proteinet i en opløsning, der kun indeholder flygtige forbindelser og let kan fryses. HPLC-oprensning resulterer ofte i denaturering af de oprensede proteiner og er således ikke anvendelig på proteiner, der ikke spontant genfoldes.