abstrakt
neuraminidase (NA) spiller en væsentlig rolle i frigivelse og spredning af afkom virioner efter den intracellulære virale replikationscyklus. For at teste, om NA også kunne lette virusindtrængning i cellen, inficerede vi kulturer af humant luftvejsepitel med humane og aviære virus i nærvær af NA-hæmmeren oseltamivir carboksylat. Tyve til 500 gange mindre celler blev inficeret i lægemiddelbehandlede versus ikke-behandlede kulturer (P < 0,0001) 7 timer efter viruspåføring, hvilket indikerer, at lægemidlet undertrykte indledningen af infektion. Disse data viser, at viral NA spiller en rolle tidligt i infektionen, og de giver yderligere begrundelse for den profylaktiske anvendelse af NA-hæmmere.
det antages, at den vigtigste funktion af viral neuraminidase (NA) er i det sidste infektionsstadium, når NA spalter sialinsyre fra celleoverflade og afkom virioner, der letter virusfrigivelse fra inficerede celler (1, 2). Mindre er kendt om NA-funktioner under virusindtræden i cellen. Det har længe været antaget, at NA fremmer virusadgang til målceller i luftveje ved nedbrydning af slim (3). Imidlertid er dette koncept aldrig formelt bevist på grund af manglen på et passende eksperimentelt system. Desuden er der rapporteret om nogle beviser, der argumenterer imod NA ‘ s rolle i de tidlige stadier af infektion (gennemgået i reference 2).
for at løse dette problem undersøgte vi virkningerne af Na-hæmmeren oseltamivir carboksylat (OC) (9) på indtrængen af virus i kulturer af humant luftvejsepitel. Primære humane tracheobronchiale epitelceller (HTBE; Klonetik) og primære nasale epitelceller (PromoCell GmbH) blev dyrket på membranunderstøtninger (12 mm Transvelklar; Corning, Inc.) ved luft-væske interface i serum-fri vækstfaktor og hormon-suppleret medium (6, 8). Fuldt differentierede 4 til 8 uger gamle kulturer blev brugt til alle eksperimenter. Disse kulturer var pseudostratificerede og polariserede; indeholdt basale, cilierede og slim-udskillende celler; og lignede meget humant luftvejsepitel in vivo (Fig. 1). OC (1 liter, hvis ikke angivet andet) blev tilsat til virussuspensioner og til basolaterale rum i kulturerne kort før infektion af to replikatkulturer fra den apikale side. To kontrolkulturer blev inficeret i fravær af inhibitor. En time efter infektion fjernede vi virusinokulumet og inkuberede kulturer ved luft-væske-grænsefladen i yderligere 6 timer for at tillade intracellulær virusreplikation. Kulturerne blev derefter fikseret, og inficerede celler blev identificeret ved farvning med polyklonal antisera til hele vira efterfulgt af tilsvarende peroksidasemærkede sekundære antistoffer (Dianova) og aminoethylcarbasolsubstrat (Sigma). Positiv farvning indikerede vellykket virusindgang i cellen. Kulturerne blev analyseret da ansigt ved en forstørrelse på kr. 300 (Olympus IMT-2). Et samlet antal celler, der udtrykker viralt antigen, blev talt i epitelsegmentet, der omfattede alle på hinanden følgende mikroskopiske visninger (0,28 med 0,42 mm) langs kulturens diameter (segmentoverfladeareal, 3 mm2; antal celler pr.segment, omkring 30.000). Kultur blev talt ved at dreje kulturen med uret med 45o. dataene for otte segmenter af to replikatkulturer blev gennemsnitligt.
i to eksperimenter ved anvendelse af HTBE – kulturer inficerede den humane virus a/Memphis/14/96 (H1N1) 22-og 65 gange færre celler i nærvær af NA-hæmmer sammenlignet med kontroller (Fig. 2; Tabel 1) (P < 0, 0001). Virus A/Duck/Alberta/119/98 (H1N1) fra en vild vandfugl og A/Tyrkiet/Italien/2379/99 (H7N1) fra tamfjerkræ var også markant følsomme over for oC i disse kulturer. I nasale epitelkulturer reducerede OC human-og andevirusinfektion henholdsvis 120 og 520 gange. Disse resultater indikerede, at inhibering af viral NA undertrykker initieringen af virusinfektion.
a/Chicken/Germany/R28/03 (H7N7) hører til den højpatogene aviærflygevirus, der forårsagede udbrud af hønsepest i kommercielle fjerkræbedrifter i Holland, Belgien og Tyskland i 2003. Disse vira blev overført til mindst 89 mennesker, hvoraf de fleste havde konjunktivitis, men et dødeligt tilfælde af lungebetændelse forekom også (5). H7n7-kyllingevirusinfektionen i htbe-kulturer blev reduceret 140-og 40-gange i nærvær af henholdsvis 1 og 0,1 liter OC. Disse koncentrationer repræsenterede typiske plasmakoncentrationer af lægemiddel opnået hos mennesker efter administration af 75 mg oseltamivirphosphat, den anbefalede dosis til profylakse (9).
for at bekræfte hypotesen om, at infektionshæmning i vores eksperimenter var direkte relateret til inhiberingen af viral na-aktivitet, brugte vi human A / Sydney/5/97-ligesom virus (H3N2) og dens oseltamivir-resistente mutant med en r292k-substitution i NA, hvilket gør NA 9.000 gange mindre følsom over for inhibering af OC (4). I overensstemmelse med hypotesen blev den overordnede humane virus stærkt hæmmet af OC, hvorimod kun et marginalt niveau af inhibering af den resistente mutant blev observeret, når begge vira blev testet i det samme eksperiment i HTBE-kulturer (tabel 1). Indtil nu har der ikke været nogen tilstrækkelig cellekulturanalyse til overvågning af resistens over for na-hæmmere på grund af uoverensstemmelsen mellem sialinsyrereceptorer hos mennesker og i konventionelle laboratoriecellelinjer (9, 11). Vores resultater antyder, at differentierede kulturer af humant luftvejsepitel kan være et egnet cellekultursystem til påvisning af resistens over for NA-hæmmere.
endelig brug af lægemiddelfølsom A / Sydney/5/97-ligesom virus testede vi infektionshæmning af OC tilføjet på forskellige tidspunkter efter virusinokulation. Mens 47 gange færre celler blev inficeret, da lægemidlet blev tilsat kort før infektionen, resulterede en 1-timers forsinkelse i tilsætning af OC kun i 1,5 gange hæmning med hensyn til den ikke-behandlede kontrol (tabel 1). Hvis lægemidlet blev tilsat 4 timer efter virusinokulation, blev der ikke observeret nogen statistisk signifikant inhibering. Disse data antydede, at OC påvirkede de tidligste stadier af infektion forud for virusreplikation.
sammenfattende har vi her for første gang givet direkte eksperimentelle beviser for NA ‘ s væsentlige rolle på stadiet af virusinvasion af det cilierede epitel af humane luftveje. NA-funktionen på dette stadium er mest sandsynligt fjernelse af lokkeceptorer på muciner, cilia og cellulær glycokaliks, stærk binding til hver af dem ville hindre virusadgang til funktionelle receptorer på overflademembranen i målceller. Imidlertid kan andre NA—funktioner-for eksempel fremme af hæmagglutinin—medieret fusion (7) – ikke udelukkes, og yderligere undersøgelser er nødvendige for at specificere de nøjagtige mekanismer, hvormed NA fremmer virusindtræden i luftvejsepitelceller.
da der endnu ikke er nogen vaccine mod højpatogene h7n7-og H5N1-virus, er antivirale lægemidler fortsat den eneste mulighed for at bekæmpe aviær flu (10). NA-hæmmere tolereres godt og er effektive mod alle stammer af A-og B-vira. Der har været lidt bevis for fremkomsten af viral resistens, og infektiviteten af mutante vira er normalt kompromitteret (9, 11). Na-hæmmernes evne til at undertrykke infektion før virusindtræden i celler understreger deres store potentiale for forebyggende foranstaltninger. I særdeleshed, vores data giver det videnskabelige grundlag for at understøtte den profylaktiske anvendelse af disse forbindelser til personer med høj risiko for infektion med aviær virus.
