kort introduktion: Blotting teknikker
Blotting anvendes i molekylærbiologi til identifikation af proteiner og nukleinsyrer og anvendes i vid udstrækning til diagnostiske formål. Denne teknik immobiliserer molekylet af interesse på en understøtning, som er en nitrocellulosisk membran eller nylon. Det bruger hybridiseringsteknikker til identifikation af de specifikke nukleinsyrer og gener.
blottingsteknikken er et værktøj, der anvendes til identifikation af biomolekyler såsom ad DNA, mRNA og protein under forskellige stadier af genekspression. Proteinsyntese involverer ekspression af et DNA-segment, der omdannes til mRNA for at producere det respektive protein.
undertyper af blotting som nordlige, vestlige & sydlige afhænger af det målmolekyle, der søges. Når en DNA-sekvens er grundlaget eller koden for et proteinmolekyle, kan det særlige DNA-molekyle af interesse blottes ved hjælp af sydlig Blottingsteknik. Under genekspression, når DNA ‘ et udtrykkes som mRNA for en proteinproduktion, kan denne proces identificeres ved nordlig blotting. Endelig producerer det kodede mRNA det pågældende protein, Denne proteinidentifikation kan udføres ved vestlig Blotting.
generel procedure for blotting
- Homogeniser prøven.
- adskillelse af molekylet af interesse ved hjælp af en elektroforesemembran.
- overførsel af molekylerne til en nitrocellulosemembran/ nylonmembran.
- hybridisering eller identifikation af molekylet
Northern Blotting
Northern Blotting er en teknik, der anvendes til undersøgelse af genekspression. Det gøres ved påvisning af bestemt RNA (eller isoleret mRNA). mRNA er generelt repræsenteret som 5% af den samlede RNA-sekvens. Denne metode afslører identiteten, antallet, aktiviteten og størrelsen af det bestemte gen. Denne blottingsteknik kan også bruges til vækst af et væv eller en organisme. I forskellige stadier af differentiering og morfogenese ændres overfloden af et RNA, og dette kan identificeres ved hjælp af denne teknik. Det hjælper også med at identificere unormal, syg eller inficeret tilstand på molekylært niveau. Northern blot-teknikken blev udviklet i 1977 af David Kemp og George Stank ved Stanford University. Teknikken fik sit navn på grund af ligheden mellem processen og den sydlige blotting. Den primære forskel mellem disse to teknikker er, at nordlig blotting kun vedrører RNA.
princip
som al normal blottingsteknik starter northern blotting med elektroforese for at adskille RNA-prøver efter størrelse. Elektroforese adskiller RNA-molekylerne baseret på ladningen af nukleinsyrerne. Ladningen i nukleinsyrerne er proportional med størrelsen af nukleinsyresekvensen. Således adskiller elektroforesemembranen Nukleinsyresekvensen i overensstemmelse med størrelsen af RNA-sekvensen. I tilfælde, hvor vores målsekvens er et mRNA, kan prøven isoleres gennem oligo-cellulosekromatografiske teknikker, da mRNA er kendetegnet ved poly(a) – halen. Da gelmolekyler er skrøbelige, overføres de adskilte sekvenser til nylonmembranerne. Udvælgelsen af nylonmembran bidrager til den faktor, at nukleinsyrer er negativt ladede i naturen. Når RNA-molekylerne er overført, immobiliseres det ved kovalent binding. Sonden tilsættes derefter, sonden kan være komplementær en ss DNA-sekvens. Formamid anvendes generelt som en blotting buffer, da det reducerer udglødningstemperaturen.
Procedure
- den opsamlede vævs-eller kulturprøve homogeniseres først. Prøverne kan være repræsentative for forskellige typer kultur til sammenligning, eller det kan være til undersøgelse af forskellige vækststadier inde i kulturen.
- RNA-sekvensen adskilles i elektroforeseenheden en agarosegel anvendes til formålet med nukleinsyreseparationen.
- nu overføres den adskilte RNA-sekvens til nylonmembranen. Dette gøres ved to mekanismer kapillær handling og den ioniske interaktion.
- overførselsoperationen udføres ved at holde gelen i følgende rækkefølge. Først placeres agarosegelen på bunden af stakken efterfulgt af blottemembranen. Oven på disse papirhåndklæder placeres en mild vægt (glasplade). Hele opsætningen opbevares i et bægerglas indeholdende overførselsbuffer.
- RNA overført til nylonmembranen fastgøres derefter ved hjælp af UV-stråling.
- den faste nylonmembran blandes derefter med prober. Proberne er specielt designet til genet af interesse, så de vil hybridisere med RNA-sekvenser på blottet svarende til sekvensen af interesse.
- blot-membranen vaskes for at fjerne uønsket sonde
- mærket sonde detekteres ved kemiluminescens eller autoradiografi. Resultatet bliver mørke bånd i røntgenfilm.
GEl og prober
RNA-prøverne adskilles ved hjælp af agarosegeler ved anvendelse af formaldehyd som denatureringsmidler, men i små RNA-eller mikro-RNA-sekvenser kan polyacrylamidsekvenser med urinstof som denatureringsmiddel også anvendes. Ethidiumbromid kan anvendes som farvningsmiddel. To typer markører er til størrelsesmærkning. En RNA-stige og ribosomal underenhed anvendes til identifikation af størrelsen af RNA-sekvenserne.
prober kan være komplementære til hele eller en del af RNA af interesse. De kan være RNA, DNA eller oligonukleotider af 25 komplementære basepar til mål-RNA ‘ et. I tilfælde af RNA-prober anvendes invitro-producerede prober, da invivo-prober kan denaturere på grund af den strenge vask. I tilfælde af cDNA er proberne mærket med radioaktive isotoper, alkalisk phosphatase eller peberrodsperoksidase i tilfælde af kemiluminescens.
