Oncology Reports

introduktion

selvom nye terapier for nylig er blevet indført i klinisk praksis til behandling af avanceret prostatacancer, har prostatacancer forblevet den næstdødeligste kræft hos mænd i USA i 2014 (1). Nye terapeutiske mål og strategierer presserende nødvendigt for yderligere at forbedre det kliniske resultat afpatienter med prostatacancer.

et lovende potentielt terapeutisk mål ercyclinafhængig kinase 5 (CDK5). CDK5 er en serin / threonin kinasestrukturelt ligner andre CDK ‘er (2). CDK5 ser ikke ud til at have en storrolle i cellecyklusregulering (3,4). Det har været godt karakteriseret for sin dominerende rolle i udviklingen af centralnervesystemet, herunder roller inden for neuronal migration, differentiering og vedhæftning (5,6). Viog andre viste efterfølgende, at CDK5 spiller en vigtig rolle ikræftudvikling og metastase (7-12). I prostatacancerceller viste vi, at CDK5 var kritisk forcytoskeletal integritet, cellemigration og invasion og invivo for metastase (7). Inpancreatisk kræft, CDK5 er iboende for KRAS-signalering gennem den centralt vigtige RAL-signaltransduktionsvej, hvilket giver et potentielt ‘druggable’ mål for mutante KRAS-tumorer (8). Tilsammen indikerer disse undersøgelser, athæmning af CDK5, alene eller i kombination med andre midler, kan give en effektiv terapeutisk strategi for disse og andrekræfttyper.

i denne undersøgelse satte vi os for at identificere agenterdet ville være særligt effektivt i kombination med CDK5inhibition i prostatacancerceller. Derfor udførte vi ascreen af Johns Hopkins Drug Library (JHDL). JHDL er en samling af 3.360 farmaceutiske forbindelser, der med succes har gennemført sikkerhedstest hos mennesker til en række anvendelser(13,14). Dette bibliotek er blevet anvendt med succes til genanvendelse af forbindelser til kræftbehandling, herunder identifikation af digoksin som en HIF1a-hæmmer (15) og angiogenesinhibitor (16). Vi har tidligere ansat JHDL til at identificere cetrimoniumbromid og irinotecan somforbindelser med øget antitumoraktivitet mod prostatacancerceller, der udtrykker lave niveauer af metastaseundertrykkelsesgenet N-mycreguleret Gen 1 (NDRG1) (17).Her, vi udførte en lignende jhdl-screening med prostatacancerceller, der adskiller sig i CDK5-aktivitet. Tiloron blev identificeret som enforbindelse med in vitro syntetisk dødelighed inCDK5-mangelfulde prostatacancerceller.

materialer og metoder

cellekultur

PC3 prostatacancercellelinjer blev opnået fraatcc. Disse celler er afledt af en knoglemetastase fra en 62-årig prostatacancerpatient. Humane prostata fibroblaster, kindlypræsenteret af Dr. J. Isaacs, blev opnået fra en prostata biopsi på A62-årig prostatacancerpatient med en Gleason score på 4. Bothcell linjer blev dyrket og vedligeholdt i rpmi-1640 (Invitrogen)medier suppleret med 10% føtal bovint serum. Celler blev dyrketi en befugtet inkubator ved 37 liter C i en 5% Co2atmosfære.

oprettelse af PC3 CDK5dn-cellelinjen

tab af CDK5-funktion blev opnået i PC3-cellerved transfektion af en dominerende-negativ konstruktion indeholdende en D144Nmutation, venligt leveret af Dr. H. Tsai (Harvard Medical School)(18). Den anvendte protokol er tidligere blevet beskrevet (7). Kort sagt blev konstruktionen subkloneret i en tovejs tet-vektor, pBI-EGFP(BD Biosciences), som havde tilføjet et gen til selection (venligt leveret af Dr. K. Schuebel, Johns HopkinsUniversity School of Medicine). PBI-EGFP tom vektor eller pBI-EGFPCDK5dn vektor blev transficeret til PC3 celler, som indeholdt aTet-Off promotor construct, pTTa (BD Biosciences).

vestlig blotting

vestlig blotting blev udført som beskrevettidligere (19). Ti mikrogram afprotein blev fyldt på gelen. Primære antistoffer blev opløst iblokeringsbuffer . En 1:1.000 fortynding blev anvendt til anti – CDK5 (Sigma-Aldrich); anti-vinculin (Millipore,Upstate) blev fortyndet 1: 4.000. Sekundære antistoffer blev fortyndet Ata 1: 4.000 fortynding. Normalisering af båndintensiteten blev bæretud med husholdersken protein vinculin. Udviklede blots vardannet ved hjælp af en Microtek scanner.

Sårhelingsassay

Sårhelingsassays blev udført med confluentPC3-kontrol (indeholdende den tomme PBI-EGFP-vektor) eller PC3 CDK5dncells. En gummi-tippet skraber blev brugt til at skrabe et område af celler. Lys mikroskopiske billeder blev taget straks og 24 hafter skrabning.

lille molekylbiblioteksscreening

JHDL-biblioteket er tidligere beskrevet(13,14,17).Opbevaring og screening af jhdl-forbindelser blev udført som beskrevet tidligere (17).Kort sagt blev PC3-kontrol-og CDK5dn-celler podet i 96-brøndsplader(1 til 103 celler/brønd) og fik lov til at klæbe natten over. Derefter blev der tilsat 5 liter af lægemidler, opbevaret som stamopløsninger på 200 liter inDMSO/H2O, til komplette rpmi-medier, såceller blev behandlet i en endelig koncentration på 10 liter. Efter 48 timers behandling blev 20 liter MTS-reagens fra Celltiteren 96 liter akvatisk ikke-radioaktiv Celleproliferationsassay tilsat til hver brønd i en varighed på 2-4 timer ved 37 liter C. Plader blev analyseret under anvendelse af asoftmaks Pro plate reader (molekylære enheder). Proliferation af behandlede celler blev sammenlignet med proliferation af DMSO-behandlede PC3control-eller CDK5dn-celler (proliferationsindeks). Proliferationsindikatorer for PC3 CDK5dn-celler blev sammenlignet med proliferationsindikatorerne for PC3-kontrolceller. En PubMed-undersøgelse blev udført for atvurdere den kliniske anvendelse af potentielle hits.

MTS-analyser

MTS-analyser blev udført for at måleantiproliferativ virkning af tiloronbehandling. Tiloronedihydrochlorid (Sigma-Aldrich) blev opbevaret som en 10 mM lageropløsning i DMSO ved -20 liter C. Et tusind PC3-celler blev belagt I96-brøndplader indeholdende 100 liter komplette RPMI-medier. Ved ca. 50% sammenløb blev tilorondihydrochlorid administreret. Foreksperimenter blev forbindelsen fortyndet i komplette rpmi-medier for at opnå den ønskede endelige koncentration. Efter behandling i 72 timer(tiloronmonoterapi) blev MTS-reagens tilsat, og absorption at490 nm blev bestemt ved anvendelse af en Softmaks Pro-pladelæser.Proliferationsindekser blev beregnet; ubehandlede PC3-kontrol-orCDK5dn-celler (i 103-komplette rpmi-medier) blev anvendt som acontrol. Elevens t-test blev udført for at vurdere p-værdier.

Klonogene assays

Klonogene assays blev udført for at vurdere langtidsoverlevelse efter tiloronbehandling. Prostatacancerceller varplade i 60 mm retter og fik lov til at klæbe. Ved 50-60% konfluens blev celler behandlet med Tiloron i 72 timer. derefter blev 1 liter 103 celler fra hver skål belagt i tre eksemplarer i60 mm retter og inkuberet i komplette RPMI-medier i 12 dage.Kolonierne fikseres og farves med en opløsning indeholdende 90% methanol og 10% krystalviolet opløsning (2,3% krystalviolet, 0,1% ammoniumoksalat og 20% ethylalkohol; Sigma). Kolonier blev scannet med en Computerscanner (Microtek) og tælles manuelt.Studentens t-test blev udført for at evaluere, om forskelle mellem cellelinjer var statistisk signifikante.

3D vækst assay

3D vækst assays blev udført under anvendelse af sameprotocol som beskrevet tidligere (17). Kort sagt blev sfæroider genereret af dyrkning af PC3-celler i 16 timer som et hængende fald over en befugtet plade i en CO2-inkubator i komplet RPMI-medieindeholder 0,5% methylcellulose. Sfæroider blev indlejret ikollagenmatricen (Bd Biosciences), behandlet med Tiloron og billedetved hjælp af et Nikon Eclipse ti-mikroskop (Nikon) på behandlingsdagen og seks dage efter behandlingsstart. Spheroid og total (spheroidplus spirer) områder blev målt med ImageJ. Foldstigninger blev beregnet ved at dividere sfæroid/samlet areal på dag 6 med thespheroid/samlet areal på dag 0 for hver enkelt sfæroid. For hver celle linje og tidspunkt, fold stigninger på fire sfæroider var averaged. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af Student ‘ St-tests.

resultater

undertrykkelse af CDK5-aktivitet

PC3 prostatacancerceller blev valgt til jhdlforbindelsesskærmen på grund af deres stærkt metastatiske potentiale ogandrogen uafhængighed, hvilket ligner aggressiv metastatiskkastratresistent prostatacancer. CDK5-aktivitet blev hæmmet afoverførsel og udvælgelse af en dominerende negativ mutation (CDK5144N). Disse PC3 CDK5dn-celler havde et højere proteinniveau på totalCDK5 sammenlignet med PC3-kontrolcellerne (PC3-celler transfektet med en tom vektor) (Fig. 1A). I modsætning til PC3control-cellerne havde PC3 CDK5dn-celler ikke evnen til at invadere det skrabede overfladeareal (Fig.1B).

Biblioteksskærm for forbindelser, der er målrettet mod PC3-celler baseret på CDK5-aktivitet

der blev udført et screeningsassay med høj kapacitet for at vælge forbindelser, der er målrettet mod PC3-celler baseret på CDK5-aktivitet. PC3control-og CDK5dn-celler blev behandlet med alle forbindelser afjhdl ved 10 liter i 48 timer. For at identificere hits, der selektivt målretter modpc3-celler baseret på CDK5-ekspression, valgte vi alle forbindelser isom proliferationsindeksforholdet (CDK5dn/control) var under 0,5 eller over 1,5 (Fig. 2A).Desuden måtte hits hæmme celleproliferation af PC3-celler med mindst 10%, da vi specifikt var interesserede i forbindelser derhæmmede cellevækst (vandret og lodret linje i graf). Vi valgte også alle forbindelser, der hæmmede celleproliferation ipc3 celler med 70% (nederste venstre hjørne af grafen), da vi varinteresseret i at identificere potentielle meget effektive antitumoragenter. I alt blev 41 hits udvalgt til yderligere evaluering.

der blev udført en sekundær skærm, hvor udvalgte hits fra den primære skærm blev tilføjet ved 10 liter i 48 timer til PC3control-og CDK5dn-celler i tre eksemplarer for at udrydde falske positiveresultater (Fig. 2B). Afskæringsværdiervar lidt mindre strenge end i den primære skærm; forbindelser blev betragtet som et hit, når forholdet mellem spredningsindekser(CDK5dn/control) var under 0,7 eller over 1,4. Dette resulterede iidentifikation af tre forbindelser, der selektivt målretter modcdk5-udtrykkende PC3-celler: rutilantin, ethacridinlactat ogcetalkoniumchlorid (Fig. 2C).Disse forbindelser er ikke blevet anvendt som antitumormidler og derespotentiel klinisk anvendelse som intravenøse antitumormidler synesbegrænset (20-23). En anden forbindelse, tiloronanalogr9536-da, var yderst effektiv til at hæmme begge isogene PC3-cellelinjer (>70% inhibering), men det hæmmede proliferation af PC3CDK5dn-celler noget mere effektivt (forhold CDK5dn/kontrol:0,687). Tiloron og dets analoger har antiviral aktivitet, der i det mindste delvis virker som interferoninducerende midler (24-26)og har også vist sig præklinisk og klinisk at have antitumoraktivitet (27,28).

Tiloron målretter selektivt PC3-cellermed lav CDK5-aktivitet

vi fortsatte vores eksperimenter med frisk opløsttilorondihydrochlorid. Efter 72 timers tiloronbehandling påforskellige koncentrationer blev dens IC50 etableret ved 8-12-larm i PC3 CDK5dn-celler og 15 larm i PC3-kontrolceller i MTS-analyser(Fig. 3A). Ved 8 liter blev proliferationsaktiviteten reduceret med henholdsvis 24% og 47% i PC3-kontrol-og CDK5dncells (p=0,001). For at vurdere toksicitet af Tiloron inormale prostataceller blev MTS-analyser udført med tiloronbehandling af humane prostatafibroblaster (Fig. 3B). Følsomheden af disse celler totiloron svarede til PC3-kontrolcellerne.

den inhiberende virkning af tiloron i PC3-celler blev yderligere vurderet ved at udføre klonogene assays (Fig. 3C). PC3 CDK5dn-celler var ogsåvæsentligt mere følsomme end PC3-kontrolceller over for Tiloron i dette assay. Behandling med 10 liter tiloron resulterede i klonogenoverlevelse på 40% i PC3 CDK5dn-celler og 72% i PC3-kontrolceller(p=0,002).

der blev udført en sfæroidvækstassay for at vurdere 3dtumorvækst og invasion af PC3-celler ved tiloronbehandling(Fig. 4). Både PC3-kontrol og PC3CDK5dn-celler havde sammenlignelige stigninger i sfæroidstørrelse over seks dage. Imidlertid havde den samlede størrelse (størrelsen af sfæroider plus spirer) en højere foldstigning i PC3-kontrolceller, hvilket bekræftede, at ikke-behandlede PC3 CDK5dn-celler havde et nedsat invasivt potentiale sammenlignet med PC3-kontrolceller. Når Tiloron blev administreret ved 5 liter, havde PC3 – kontrolsferoider et lignende vækst-og invasivt mønster som de ubehandlede PC3-kontrolceller (p=0,59) (Fig. 4B, venstre graf). Men nårentiloron blev administreret i samme koncentration til PC3 Cdk5dnceller, blev der observeret et signifikant fald i både sfæroidstørrelse og total størrelse (p<0,01), hvilket tyder på, at Tiloron med succes hæmmer sfæroidvækst og invasion af PC3 CDK5dn-celler, når de blev administreret ved 5 liter (Fig. 4B, højre graf). Ved 10 liter havde begge isogene cellelinjer et faldinvasivt potentiale.

Diskussion

JHDL, et bibliotek med velkarakteriserede farmaceutiske forbindelser, blev udviklet for at lette narkotikareparationsstudier (29). De omfattende in vivo toksicitet og farmakokinetiske profiler af forbindelser i biblioteket muliggør hurtig efterfølgende udvikling af disse forbindelser. Flere forbindelser fra JHDL er blevet avancerettil kliniske forsøg for kræft og andre terapeutiske anvendelser(13,14,16,17,30–32).

i den foreliggende undersøgelse screenede vi jhdl forforbindelser, der differentielt hæmmer kræftcellevækst iTilstedeværelsen af CDK5-hæmning; Tiloron og en tiloronanalog blev identificeret som midler, der selektivt målretter mod CDK5-mangelfulde Pc3prostatacancerceller. Tiloron (Amiksin IC) anvendes kliniski nogle lande som et oralt aktivt antiviralt middel (25). Tiloron er blevet testet hos menneskertil behandling af cerebrale gliomer, laryngeal papillomatose ogbrystkræft (28,33,34).Selvom der blev rapporteret om antitumoreffekt, er interessen for Tiloron forcancerbehandling aftaget. For nylig rapporterede jou et alnye tiloronanaloger med forbedret anticanceraktivitet (35). Disse analoger kan være lovende atundersøge, især i kombination med CDK5-hæmning.

ud over muligheden for, at Tiloron kan være lovende i kombination med CDK5-hæmning, antyder identifikationen af tiloron som et middel, der selektivt målretter celler inden forinaktiv CDK5, potentielle klasser af lægemidler til at forstærke effekten af CDK5-hæmning. Tiloron er blevet karakteriseret som aninterferon inducer (24). Detteantyder, at interferon selv eller en alternativ interferoninducer, såsom en TLR-agonist, kan være nyttig i kombination med aCDK5-hæmmer. Ikke desto mindre kan andre mekanismer være involveret. For eksempel er tiloron også et DNA-interkalerende middel (24), og man kan forestille sig, at det kanmodulere kromatinstruktur og genekspression. Andre funktioner af Tiloron, herunder signalvej og transkriptionsfaktorinteraktioner (36,37), kan også være involveret. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at opgrave den nøjagtige virkningsmekanisme, hvormedtiloron selektivt målretter CDK5-negativ prostatacancerceller.

anerkendelser

forfatterne ønsker at takke professorer P. J. Van Diestand E. Van Der væg for deres støtte og diskussion og ProfessorsM.A. Carducci og J. T. Isaacs for deres levering af laboratoriematerialer. Denne undersøgelse blev støttet af Flight Attendant MedicalResearch Institute, NCI R01 CA085567, R01 CA134767, dod tilskud 81-06-1-0139 og NCI Sport give P50 CA58236. M. D. V. blev støttet af Dr. Saal van Gianenbergstichting og Huygensskoleprogrammet.