PMC

1detaljerede protokoller og fejlfindingstips til alle aspekter af GST-genfusionsproteinekspressionssystemet er tilgængelige fra GE Healthcare i håndbøgerne: GST-Genfusionssystem, produktnummer 18-1157-58 og rekombinant Proteinhåndbog, produktnummer 18-1142-75. Håndbøgerne kan købes i papirkopi eller kan fås som PDF på GE Healthcare hjemmeside.

2brug af JM105 eller en lignende stamme anbefales til kloning og vedligeholdelse af vektoren. Stammer af BL21 og dets derivater eller en anden proteasemangelstamme anbefales til maksimal proteinekspression. Stammer, der mangler cytoplasmatiske proteasegenprodukter, såsom lon, ompT, degP eller htpR, kan minimere virkningerne af proteolytisk nedbrydning af overudtrykt protein af værten. Brug ikke en stamme af E. coli, der bærer rec1A-allelen til at udbrede pgeksplasmider, da der er rapporteret om sletninger eller omlejringer af plasmid-DNA.

3glutathion Sepharose 4B bulkmedier anvendes i denne oprensningsprotokol. Denne kromatografi medier er ideel til screening betingelser og giver mulighed for nem opskalering. Rensninger udføres let ved hjælp af enten tyngdekraftstrøm eller et lavtrykskromatografisystem eller kan anvendes til batchrensninger baseret på centrifugering. GSTrap FF affinity kolonner er 1 ml eller 5 ml færdigpakkede kolonner, der også er tilgængelige og kan tilsluttes i serie til opskalering. Disse kolonner er til brug med et væskekromatografisk system, en pumpe eller sprøjte. Ud over disse formater er glutathion Sepharose også tilgængelig i spin-kolonner og 96-brøndspladeformater til hurtig screening af GST-fusionsproteinekspression og oprensningsbetingelser.

4dfp er et ekstremt farligt neurotoksin. Følg de forholdsregler, der er leveret af producenten, og håndter kun det pæne reagens i en kemisk Røghætte.

5tilsætning af proteasehæmmere til lysisbufferen vil bidrage til at forhindre proteolytisk nedbrydning af målproteinet under ekstraktion. Imidlertid bør den nøjagtige cocktail af proteasehæmmere tilsat til lysisbufferen skræddersys til målproteinets egenskaber. Reduktionsmidler såsom 2-ME, DTT eller TCEP i koncentrationer på 1-10 mM skal tilsættes bufferen efter behov. Tilsætning af et ikke-ionisk rengøringsmiddel, såsom 1% Triton H-100, kan også tilsættes bufferen for at hjælpe med ekstraktion.

6følgende er en screeningsprotokol til kontrol af proteinekspressionsniveauer af fusionsprotein i minikulturer. Tilstedeværelsen af en stigning i proteinniveauer ved den forventede molekylvægt på en SDS-side gel efter induktion med IPTG er en god indikation af vellykket proteinekspression. Efter induktion skal et fremtrædende bånd med den forventede molekylvægt (molekylvægt af målprotein + ~ 26 KDa for GST-delen) være synlig. Hvis der er mistanke om, at proteinet udtrykkes på et lavt niveau, kan verifikation af korrekt ekspression udføres ved anvendelse af vestlig blotting med et antistof, der er specifikt for enten målproteinet eller GST. Hvis prøverne ikke umiddelbart analyseres af SDS-PAGE, kan de opbevares natten over ved 4-liter C eller ved -20-liter C til længerevarende opbevaring.

1. Inokuler flere isolerede kolonier i separate 50 ml centrifugerør indeholdende 10 ml LB suppleret med 100 liter/ml ampicillin. Dyrk en overnight kultur på 37 liter C med omrystning.

2. den næste morgen tilsættes 0,5 ml natten over kultur til 4,5 ml LB med 100 liter/ml ampicillin. Vokse 1 time ved 37 liter C.

3. Fjern 1 ml ikke-induceret prøve. Centrifuge og fjern supernatant. Frys eller opbevar på is, indtil den er klar til at køre SDS-PAGE.

4. tilsæt IPTG til en endelig koncentration på 1 mM og vokse i yderligere 2-3 timer.

5. Fjern 1 ml induceret prøve. Centrifuge og fjern supernatant. Frys eller opbevar på is, indtil den er klar til at køre SDS-PAGE.

6. Resuspend cellepellets i 200 liter SDS-side prøvebuffer; varme 3-5 min ved 90 liter C.

7. analyser 5-10 liter ved hjælp af SDS-side efterfulgt af coomassie blå farvning (eller 1-2 liter for vestlig plet).

7prøver dyrket i minikulturer kan også bruges til at evaluere opløseligheden af et bestemt fusionsprotein (se Note 6 for minikulturekspressionsprotokol). Ved afslutningen af induktionsperioden høstes cellerne ved centrifugering. Opbland pelleten i 200 liter kold PBS. Lys cellerne ved hjælp af sonikering; hold prøven på is. Gem en lille alikvot af lysatet til analyse af SDS-side. Centrifuger den lyserede prøve i 15 minutter. Fjern supernatanten til et separat rør. Opbland pelleten i 200 liter PBS. Analyser noget af det rå lysat, supernatanten og den resuspenderede pellet ved SDS-PAGE eller vestlig blotting. Hvis prøven observeres i både lysat-og supernatantfraktionen, er prøven tilstrækkeligt opløselig. Hvis prøven primært er til stede i lysatet og resuspenderet pellet, er prøven sandsynligvis i okklusionslegemer. I tilfælde, hvor proteinet er placeret i inklusionslegemer, skal du undersøge forskellige ekspressionsbetingelser for at skifte ekspression til en opløselig form (se Note 8).

8hvis fusionsproteinet primært udtrykkes i inklusionslegemer (f. eks. > 80% uopløselig), kan forskellige strategier anvendes til at forbedre opløseligheden. Ofte er induktion ved lavere temperatur (15-25 liter C) effektiv til at skifte ekspression fra inklusionslegemer til den opløselige fraktion. Celler induceret ved denne lavere temperatur vil vokse langsommere og vil kræve induktionsperioder natten over. Anvendelse af alternative værtsstammer eller modifikationer af plasmidkonstruktionen kan i nogle tilfælde være nødvendig. Hvis fusionsproteinet primært forbliver i inklusionslegemer, selv efter forsøg på at opnå opløseligt protein, kan det være umagen værd at opskalere produktionen af E. coli og rense nok protein fra den lille mængde opløseligt protein, der er til rådighed. I nogle tilfælde bør andre fusionsproteinmærker undersøges.

9 lave proteinekspressionsniveauer kan være resultatet af sjælden kodonbrug. I dette tilfælde kan skift til en anden stamme af E. coli, der indeholder ekstra udskrifter for sjælden codon tRNA, forbedre proteinproduktionen markant. Forskellige medieformuleringer eller tilsætning af op 2% glucose kan også forbedre ekspression (13, 14). Hvis det er mistanke om, at det udtrykte protein er giftigt for cellerne (normalt vil de stoppe med at vokse efter induktion med IPTG), prøv at inducere på et senere tidspunkt i kortere tid. At reducere IPTG-koncentrationen er en anden mulighed, der bør undersøges.

10monitorcellevækst ved at læse den optiske densitet ved 600 nm (A600). En overnight kultur bør nå en A600 ~1-1.2. Celler skal induceres i en tidlig fase af den logaritmiske vækstkurve for E. coli, A600 ~ 0,5 til 0,7. Ved 37 kr. vil det tage cirka 2 timer for kulturer at nå et tidligt vækststadium. Hvis celler dyrkes ved en lavere temperatur, skal inkubationstiden øges, da cellerne vokser langsommere ved lavere temperaturer. Generelt opnås det største udbytte af fusionsprotein, når cellerne induceres ved A600 = ~ 0,5. Efter induktion med IPTG, en generel retningslinje for inkubationstid er som følger: 3 h ved 37 Chr C, 5 h ved 30 Chr C, og natten over for 25 Chr C eller lavere. Høst cellerne før mætning, A600 ~ 1,0-1,2.

11for at sikre tilstrækkelig beluftning skal kolber kun fyldes til 20-30% af deres kapacitet.

12det er vigtigt, at der ikke er nogen serinproteasehæmmere til stede i prøven før spaltning med thrombin eller faktor HSA. Aebsf, APMSF, antithrombin III, antipain, larr1-antitrypsin, aprotinin, chymostatin, hirudin, leupeptin og PMSF. Desuden er pefabloc et specifikt lægemiddel for thrombin, og Pefabloc er specifikt for faktor KSA. Følgende proteasehæmmere bør undgås ved Prescisionsprotease: 100 mm Ncl2, 100 chymostatin og 4 mM Pefabloc.

13der er en række alternative metoder til påvisning af GST-fusionsproteiner. For proteiner, der udtrykker sig godt på et højt niveau, er den enkleste metode til overvågning af rensningen via SDS-side geler farvet med Coomassie blå eller sølvfarve. Et alternativ til proteiner, der udtrykker ved lave niveauer, er at bruge vestlig blotting ved hjælp af et antistof rettet mod enten GST eller målproteinet. Et alternativ til små udtryk er at overvåge tilstedeværelsen af GST med et ELISA-eller CDNB-assay.

14 gem en lille mængde proteinprøve fra hvert trin i oprensningen, herunder lysis, supernatant, pellet, ubundne fraktioner fra prøveindlæsning, vasketrin og elueringstrin, der skal analyseres ved SDS-PAGE eller vestlig blotting. Når alle prøver er blevet analyseret og samlet, kasseres uønskede fraktioner.

15 GST proteiner kan også renses ved hjælp af en batchrensningsmetode. En batchrensningsmetode er hurtig, nem og kræver lidt udstyr; imidlertid kan det resulterende protein indeholde flere urenheder og have et lavere udbytte end en kromatografibaseret oprensning. Batchrensninger anvendes bedst ved screening af rensningsbetingelser. Batchrensningen beskrevet nedenfor udføres generelt ved stuetemperatur. For at minimere risikoen for proteolytisk nedbrydning kan proceduren udføres ved 4 liter C ved at øge inkubationstiden 2 – til 4 gange.

1. Lyse celler og opnå opløseligt fusionsprotein (se Note 8 og 21, hvis prøven er i inklusionslegemer).

2. der tilsættes 2 ml 50% gylle glutathion Sepharose bulkmatrice (1 ml sengevolumen) pr.100 ml bakterielysat-supernatant. Inkuber 30 minutter ved stuetemperatur med mild omrøring.

3. Centrifuge 500 liter g i 5 min. Fjern supernatanten og gem til analyse af SDS-side for at bestemme bindingseffektiviteten.

4. vask harpiksen med 10 sengevolumener PBS. Opbland forsigtigt, og centrifuger derefter 500 liter g i 5 minutter. Fjern supernatanten. Gentag vaske-og centrifugeringstrin for i alt 3 vaske på 10 sengevolumener hver.

5. Eluere fusionsproteinet ved resuspendering af harpiksen med 1,0 ml glutathion elueringsbuffer pr.ml sengevolumen. Inkuber 10 minutter ved stuetemperatur. Centrifuge 500 liter g i 5 min. Overfør det fusionsproteinholdige supernatant til et separat rør. Gentag eluerings-og opsamlingstrinnene i alt 3 gange. Supernatanterne kan samles eller analyseres separat af SDS-PAGE for at overvåge proteinindholdet (Se Note 12).

16A sengevolumen er lig med halvdelen af den 50% opslæmning af glutathion Sepharose 4b, der anvendes til oprensning. Til fremstilling af en 50% opslæmning af glutathion-Sepharose (den leveres som ~ 75% opslæmning): bestem det sengevolumen, der kræves til rensningsskalaen. Opbland glutathion-Sepharosen 4B. for hver ml bed-volumen, der kræves, pipetteres 1,33 ml af 75% – opslæmningen til et centrifugerør i passende størrelse. Centrifuge ved 500 liter g i 5 min. Dekanter super. Vask med 10 sengevolumener (10 ml pr.1,33 ml original opslæmning) af PBS ved forsigtigt at vende røret flere gange for at blande, og centrifuge derefter 500 liter g i 5 min. Dekanter super. Manglende fjernelse af ethanolopbevaringsopløsningen kan forstyrre efterfølgende bindingstrin. Tilsæt 1 ml PBS for hver 1,33 ml af den oprindelige opslæmning. Dette resulterer i en 50% gylle.

17glutathion Sepharose har en annonceret minimumsbindingskapacitet på 8 mg/ml. En 20 ml søjle skal være tilstrækkelig til at rense protein fra 3 liter 600 ml E. coli kulturer, der indeholder ~ 20-40 mg fusionsprotein pr.kultur. Både den anvendte mængde harpiks og kolonnestørrelsen kan skaleres op eller ned afhængigt af mængden af protein, der skal renses.

18opsuspend pelleten ved hjælp af 25-50 liter vaskebuffer pr.ml original kultur.

19cell afbrydelse er færdig, når suspensionen delvist rydder og bliver en lidt mørkere farve. Undgå skumning under sonikering, da dette kan føre til denaturering af fusionsproteinet. Undgå oversonication, da dette kan føre til co-rensning af vært E. coli proteiner sammen med GST fusionsprotein. Høj viskositet på grund af frigivelse af nukleinsyrer under sonikering kan reduceres ved at tilføje DNase eller bensoase til lysisbufferen. Op til en koncentration på 0.2 mg/ml kan tilsættes som hjælp til cellelyse. Et alternativ til sonikering er brugen af kommercielt tilgængelige celleekstraktionsformuleringer. Disse produkter kan dog indeholde proprietære komponenter, der forstyrrer nedstrøms applikationer.

20hvis forsøg på at skifte ekspression fra inklusionslegemer til den opløselige fraktion mislykkes, kan uopløselige GST-fusionsproteiner undertiden renses i nærvær af denatureringsmidler, såsom urinstof, efterfulgt af genfoldning. Solubilisering ved hjælp af vaskemidler såsom sarkosyl (N-laurylsarosin) er også blevet anvendt med succes (15, 16). Selvom følgende protokol er blevet anvendt med succes til denaturering og re-natur GST-fusionsproteiner, er hver fusionsproteinkonstruktion unik, og de nøjagtige denaturerings-og re-naturationsbetingelser skal bestemmes empirisk. Almindelige denatureringsmidler, der er blevet anvendt med succes, inkluderer guanidin HCl, urinstof, mellem 20, CTAB og SDS (17, 18). Denatureringsmidlerne skal derefter fjernes fuldstændigt for at muliggøre korrekt genfoldning af proteinet. Betingelser, der skal optimeres for at lette genfoldning, inkluderer: type denatureringsmiddel, pH, tilstedeværelse af reduktionsmiddel, hastighed for fjernelse af denatureringsmiddel og proteinkoncentration. Når proteinet er blevet genmodificeret, skal du kontrollere, at proteinet har genvundet sin oprindelige konformation og funktion og fjerne ethvert forkert foldet protein.

1. præ-ækvilibrere glutathion-Sepharosesøjlen; sonikere de pelleterede E. coli-celler og adskille lysat-supernatanten og pelletsfraktionerne ved centrifugering (se 3.3 Affinitetsrensning af GST-fusionsproteintrin 1-8). Opbland lysatpellet, der inkluderer inklusionslegemerne, i 15 ml vaskebuffer. Centrifuge 20 min ved 48.000 liter g (4 liter C). Dekanter supernatanten, og opbland den vaskede pellet i 12 ml u-buffer (opbland den i 20 liter u-buffer pr.ml original kultur). Inkuber 2 timer på is.

2. Centrifuge 20 min ved 48.000 liter g (4 liter C). Overfør supernatanten, der indeholder det denaturerede fusionsprotein, til et rent centrifugerør.

3. 100 til supernatanten til en endelig koncentration på 1%.

4. Dialys prøven i PBS / glycerol i 2-3 timer. dialysebufferens volumen skal være mindst 20 gange prøvevolumenet.

5. Dialysere prøven natten over versus PBS med proteasehæmmere ved hjælp af et buffervolumen, der er > 100 gange prøvevolumen.

6. fjern prøven fra dialyse og centrifuge 20 min ved 4.000 liter g.

7. ekstraheret og genmodificeret protein fra inklusionslegemerne kan nu anvendes på glutathion-Sepharosekolonner og renses.

løsninger:

Wash buffer: 50 mM Tris, 5 mM EDTA, 1 µg/ml leupeptin, 1 µg/ml pepstatin, 0,15 mm PMSF, pH 8,0

U-buffer: 5 M urinstof, 50 mM Tris, 5 mM EDTA,5 mM, 2-ME, 1 µg/ml leupeptin, 1 µg/ml pepstatin, 0,15 mM PMSF, 1 mM DFP pH 8,0

PBS/glycerol: 1X PBS, 20% glycerol, 1% Triton X-100, 5 mM, 2-ME, 5 mM EDTA, 5 mM, 2 – ME, 1 µg/ml leupeptin, 1 µg/ml pepstatin, 0,15 mM PMSF, 1 mM DFP pH 7.4

21Use af en peristaltisk pumpe anbefales, at jævnt flow kontrol priser. Hvis der opstår kompression af harpiksen, er trykket for højt, og strømningshastigheden skal reduceres.

22bindingskinetikken mellem glutathion og GST er relativt langsom. Derfor er det vigtigt at anvende lave strømningshastigheder for at opnå maksimal bindingskapacitet, f.eks. 0,1 ml/min for en 2,5 cm I. D. kolonne. Brug af strømningshastigheder, der er for hurtige, kan reducere mængden af bundet fusionsprotein på grund af den langsomme kinetik af forening. Vaske-og elueringstrin kan udføres ved hurtigere strømningshastigheder for at spare tid (henholdsvis 1,5 ml/min og 0,3 ml/min). For store volumenprøver udføres binding mest bekvemt natten over med justeringer af strømningshastigheder, så søjlen ikke løber tør.

23analyse af de ubundne fraktioner vil indikere, om fusionsproteinet er bindende eller ej. Hvis proteinet ikke detekteres i tidlige fraktioner, men vises i senere fraktioner, indikerer det, at kolonnekapaciteten er overskredet. Reduktion i proteinbelastning eller stigning i kolonnestørrelse vil lindre denne tilstand.

24hvis fusionsproteinet binder dårligt til glutathion-Sepharosen, er der flere alternativer til at prøve at øge bindingseffektiviteten. Prøv en mildere lysis metode. Hvis den anvendte metode er for hård, kan proteinet blive denatureret og derfor ikke være i stand til at binde til søjlen. Hvis proteinet genmodificeres fra inklusionslegemer, skal du også sikre dig, at alle denatureringsmidler er fjernet fra bufferen, enten gennem udtømmende dialyse eller påføring af prøven på en afsaltningskolonne, inden de påføres glutathionkolonnen. Fjern ethanolopbevaringsopløsningen fra glutathion-Sepharosen; reducer søjlen med frisk glutathionbuffer efterfulgt af en vask med PBS umiddelbart før prøveindlæsning. Forøg mængden af harpiks og / eller formindsk den strømningshastighed, der anvendes til indlæsning af prøven. Prøv at tilføje 1-20 mM DTT til prøven. Hvis der stadig er et problem, skal du rengøre kolonnen i henhold til producentens anbefaling. Hvis bindingen stadig ikke gendannes, kan du prøve at bruge frisk harpiks.

25udbyttet af fusionsprotein kan også estimeres ved måling af absorbans ved 280 nm (A280). Udryddelseskoefficienten for GST-delen alene er ~ 1,5, dvs.1,00 A280 = ~ 0.6 mg/ml protein, skønt udryddelseskoefficienten for fusionsproteinet delvis afhænger af målproteinets absorbansegenskaber.

26hvis der er et problem med at eluere proteinet fra glutathion-Sepharosesøjlen, skal du prøve at sænke strømningshastigheden og øge volumenet af elueringsbuffer, der bruges. Sørg for at bruge frisk reduceret glutathionbuffer (gør det den dag, den skal bruges). Forøg koncentrationen af glutathion op til 40 mM og/eller hæv bufferens pH til pH 8,0–9,0. Tilsæt 1-20 mM DTT (eller andet reduktionsmiddel) til bufferen. Tilsætning af et ikke-ionisk vaskemiddel kan også forbedre opløseliggørelsen og minimere enhver aggregering, der måtte forekomme.

27forurening af det oprensede fusionsprotein med E. coli værtscelleproteiner er en indikation af, at sonikering har været for alvorlig. Hvis nedbrudte fragmenter af fusionsproteinet er til stede, kan du prøve at tilføje yderligere proteasehæmmere til lysisbufferen. Hold alle prøver, buffere og opsamlingsrør kolde for at minimere proteolyse. Hvis nedbrydning forekommer under proteinekspression, kan du prøve at inducere prøven sent (~0.8 OD600) og formindsk længden af induktionsperioden. Skift til en alternativ værtsstamme kan også hjælpe.

28et alternativ til fordøjelse i opløsningen er proteasespaltning af fusionsprotein, mens det er bundet til glutathion-Sepharosematricen. Fusionsproteinet ekstraheres og lægges på glutathion-Sepharosen efterfulgt af vask med PBS (se Affinitetsrensning af GST-fusionsprotein, trin 1-11). I stedet for at eluere proteinet med glutathionbuffer lægges en PBS-opløsning på søjlen og inkuberes i flere timer ved stuetemperatur (4 liter C til Prescisionsprotease). Det spaltede protein vaskes derefter ud af søjlen med flere kolonnevolumener PBS. Restfusionsprotein og GST-delen kan fjernes fra søjlen ved at vaske søjlen med reduceret glutathionbuffer. Mængden af inkubationstid skal bestemmes empirisk for hvert fusionsprotein. Analyser alle prøver efter SDS-side for at bestemme spaltningseffektivitet og proteinrenhed.

29 i en batchmodus proteasespaltning tilsættes en empirisk bestemt mængde til fusionsproteinet bundet til harpiksen (Se Note 15 a–D). Brug 1 ml PBS-indhold pr. Inkuber ved stuetemperatur i flere timer med mild omrøring. Centrifuger 500 liter g i 5 minutter for at sedimentere harpiksen. Fjern super, der indeholder målproteinet, til et separat rør. Vask glutathion-Sepharosen med PBS op til 3 gange for at genvinde det spaltede fusionsprotein. Inkuber harpiksen med glutathionbuffer for at fjerne GST og resterende fusionsprotein. Brug 1 ml glutathionbuffer pr. Centrifuger 500 liter g og genvinder elueret GST. Gentag op til 3 gange. Analyser prøver af SDS-side.

30hvis der anvendes trombinprotease, kan fordøjelsen udføres i glutathionbufferen, der anvendes til at eluere proteinet fra søjlen. Det anbefales at dialysere proteinet i enten en Tris-buffer eller PBS-buffer inden fordøjelsen; den glutathion, der er til stede i elueringsbufferen, kan forstyrre disulfidbroerne, der er til stede i faktor KSA, hvilket fører til ineffektiv fordøjelse af fusionsprotein. En empirisk bestemmelse af fordøjelsesbetingelserne for hvert fusionsprotein skal bestemmes i et pilot fordøjelseseksperiment. En praktisk metode er at fordøje 100 kg fusionsprotein over en række forhold mellem f. eks. Typiske inkubationstider varierer fra 2 til 8 timer. anbefalede 1:100, 1:350, 1:1000, og 1:3000 (enheder pr. liter fusionsprotein), og for Faktor A er 1:10, 1:25, 1:50, 1:100, 1:300 (pr. På ønskede tidspunkter fjernes 2 liter protein og stopper fordøjelsen ved at tilsætte prøveeksemplaret til kogende SDS-prøvebuffer. Analyser prøverne efter SDS-side for at bestemme de optimale spaltningsbetingelser. Overvej at ændre bufferbetingelserne, såsom at øge eller mindske NaCl-koncentrationen eller tilføje Ca2+ til bufferen (se note 31 for fejlfindingstips).

31hvis der observeres flere bånd på SDS-side for målproteinet efter fordøjelsen, skal du kontrollere målproteinsekvensen for potentielle sekundære proteasegenkendelsessteder. Hvis der findes sekundære spaltningssteder, skal du klone igen til en anden vektor. Hvis der ikke observeres nogen spaltning, skal du kontrollere DNA-sekvensen for at verificere tilstedeværelsen og integriteten af det forventede protease-spaltningssted. Sørg for, at proteasehæmmere er fjernet helt fra bufferen. Tilføj mere ilt og/eller øg inkubationstiden til natten over. Hvis fordøjelsen forbliver ufuldstændig ved de højeste forhold mellem substrat og substrat og de længste tidspunkter, skal du overveje at reengineere proteasespaltningsstedet for at inkludere flere glyciner mellem GST-delen og målproteinet for at mindske sandsynligheden for, at sterisk hindring forstyrrer spaltningen (19, 20).

32hvis inhiberingen af serinproteasehæmmere er uønsket, kan prøven påføres en HiTrap-søjle for at fjerne prøven fra prøven.

33hvis prøven skal genchromatograferes på glutathion-Sepharosesøjlen for at fjerne GST og eventuelt ufordøjet fusionsprotein, er det afgørende, at den reducerede glutathion fjernes fuldstændigt fra prøven. Glutathion ækvilibrerer meget langsomt over dialysemembraner; hvis der derfor anvendes dialyseslanger med en MVCO <12.000, kan 3 eller flere bufferændringer være nødvendige for fuldstændig fjernelse. Øget dialysetid (natten over) og et større volumen buffer kan også være påkrævet for store prøvevolumener.

34den samme glutathion-Sepharosesøjle kan anvendes både til indledende isolering af fusionsproteinet og til genrensning efter spaltning. Det anbefales at dedikere en enkelt søjle til en individuel proteinkonstruktion for at undgå potentiel krydskontaminering af forskellige rekombinante proteiner. Kolonner kan genbruges flere gange. Hvis bindingseffektiviteten falder over tid, skal du rengøre søjlen i henhold til producentens anbefalinger. Hvis bindingsaktiviteten ikke gendannes, skal der bruges en ny kolonne.

35maksimal binding opstår, hvis søjlen er helt reduceret; hvis glutathion-Sepharosesøjlen imidlertid er blevet vasket mindre end 48 timer før dette trin, kan dette trin springes over.

36målproteinet vil være i den ubundne fraktion, og GST og ethvert ikke-spaltet fusionsprotein vil binde til søjlen.

37små prøvevolumener anbefales til god opløsning af målprotein versus andre forurenende stoffer. Hvis det ikke er muligt at koncentrere prøven i et lille volumen, kan der udføres flere injektioner af prøven.