PMC

CPV-2 er det vigtigste etiologiske middel til viral gastroenteritis hos hunde. Det er medlem af Parvoviridae-familien, der tilhører slægten protoparvovirus og Protoparvovirus type 1-arter. Det er en ikke-indhyllet virus med et enkeltstrenget DNA-genom, somkoder for to kapsidproteiner, VP1 og VP2, der kræves til samling og emballering af det virale genom såvel som for ns1-og NS2-ikke-strukturelle proteiner, somhjælp til at kontrollere DNA-replikation, samling og regulering af genekspression .

i løbet af de sidste år har CPV-2 udviklet nye antigenvarianter. I 1980 blev CPV-2 original stamme erstattet af den variant, der blev betegnet type 2a (CPV-2a), i 1984 blev CPV-2b identificeret , og i 2001 blev CPV-2C detekteret og rapporteret i Italien. Den sidste variant er også blevet identificereti Asien, Afrika og Amerika. På grund af eksistensen af flere antigene varianter til CPV-2 kan de kliniske tegn variere meget .Derefter har dyrlæger mindre sikkerhed, når de udsteder deres formodede diagnose, og normalt kræves nogle laboratorietests for atbekræft deres diagnose; selvom der er udviklet flere teknikker i forskningslaboratorier, såsom hæmagglutineringsassays, immunofluorescens, ELISA, PCR,immunokromatografitest og cellekultur (blandt andre), faktisk teknikker med den største tilgængelighed inden for kliniske laboratorier på veterinærhospitalerkun er immunokromatografitesten og PCR, men i forskningen om følsomheden og specificiteten af disse procedurer er rapporterne kontroversielle.Desuden er følsomheden og specificiteten af disse teknikker hos patienter med varierende grad af sygdomsgrad ikke blevet undersøgt grundigt.

formålet med denne undersøgelse er at rapportere fordele og ulemper, der tilbydes af immunokromatografitest og PCR til diagnose af patienter, der præsenterer en bred mangfoldighed af kliniske tegn til CPV-2.

denne undersøgelse blev udført i henhold til retningslinjerne fra den eksperimentelle dyreforskning Meksikanske officielle Norm NOM-062-dyrepark-1999.

hunde med klinisk enteritis indlagt på veterinærhospitalet for små dyr fra Universidad aut Kursnoma de Estado de M, blev screenet for detteundersøgelse og udvalgt baseret på testet positiv eller negativ CPV-2 ved anvendelse af indlejret PCR (nPCR). Som et resultat blev 45 hunde, der testede positive, valgt, og 5 negativtestede hunde blev inkluderet som kontroller. De 50 hunde blev klinisk undersøgt af tre dyrlæger samtidigt for at opnå følsomhed ved klinisk diagnose. Hver dyrlæger udstedte sin formodede diagnose på en diskret måde ved hjælp af problemorienteret veterinær medicinsk journal (POVMR) som deres diagnostiske værktøj.

dernæst blev fækale prøver af alle hunde analyseret gennem PCR og immunokromatografi test, mens blodprøver blev brugt til at udføre et komplet blodtal.

nPCR betragtes som en meget pålidelig og følsom teknik til identifikation af CPV-2 virale partikler , og derfor blev følsomheden af de anvendte tests i denne undersøgelse korreleret med dem, der tidligere blev opnået fra nPCR, til CPV-2diagnose.

hundens afføringsprøver blev opnået ved hjælp af rektale vatpinde, som blev suspenderet i nuklease-frit vand og 200 liter af homogenaterne og blev anvendt forDNA-ekstraktion. Proceduren blev udført ved hjælp af DNA-ekstraktionssæt til Chiaamp-DNA-afføring (CHIAGEN, Mains, Tyskland) efter producentens anvisninger. Alle prøver blev kvantificeret ved hjælp af et kv5000 kva-spektrofotometer (Kva-teknologi, Inc., San Jose, CA, USA). 100 ng DNA af hver prøveblev anvendt til PCR-reaktioner med 50 liter slutvolumen. Tidligere blev et par primere designet i vores laboratorium til at forstærke et 275 bp-fragment, ParvoInt2FB (5′-Tcaagcagatggtgatccaag-3′) og ParvoInt2CR (5′-GGTACATTATTTAATGCAGTTA–3′) placeret ved nukleotider 1.107–1.130 og 1.360-1.382 af VP2-genet (Genbanktiltrædelsesnummer fj0051962c).

PCR-reaktioner blev udført ved anvendelse af 2 liter af hver grunder (200 nM), 12,5 liter af Gotak-grøn Masterblanding (Promega, Madison, vi,Usa) indeholdende DNA-polymerase, reaktionsbuffer (pH 8,5) og 400 liter af hvert nukleotid (dATP, dgtp, Dctp og dTTP); 3 mM MgCl2.og 28.5 liter nucleasefrit vand. Alle reaktioner blev udført under de følgende amplifikationsbetingelser; 1 cyklus ved 94 liter C i 5 minutter for initial denaturering, efterfulgt af 35 cyklusser ved 94 liter C i 30 sek, 52 liter C i 1 minut, 72 liter C i 1 minut og en endelig forlængelsescyklus ved 72 liter C i 5 minutter.

nPCR blev oprindeligt udført ved at forstærke et fragment på 1.740 bp ved hjælp af parvoekst1f (5′-ATGAGTGATGAGCAGTTCA-3′) og Parvoekst3r (5′-AGGTGCTAGTTGAGATTTTCATATAC-3′) primere og blev designet ved hjælp af nukleotidsekvenserne 1-20 og 1.712–1.740 fra Gen VP2 til hunde parvovirus (genbank tiltrædelsesnummer fj0051962c). Reaktionen varstandardiseret til et endeligt volumen på 50 liter.

reaktionsblandingen, der er indeholdt 1 µl GoTaq® Flexi DNA-Polymerase, 5 U/µl (Promega), 5 µl af GoTaq® Flexi buffer 5XGreen, 3 µl af MgCl2, 25 mM, 4 µl dNTP ‘ s 200 µM, 2 µl primer, 10 µl DNA med en endelig koncentration på 100 ng og 23 µl nuclease gratis vand. Reaktionen blev udført under de følgende amplifikationsbetingelser: 1 cyklus ved 94 liter C i 5 minutter, efterfulgt af 35 cyklusser ved 94 liter C i 30 sekunder, 50 liter C i 45 sekunder, 72 liter C i 1 minut og 1 cyklus ved72 liter C i 5 minutter. Derefter blev 1 liter af produktet af denne reaktion anvendt som en DNA-skabelon til indlejringsproceduren, og primere ogforstærkningsbetingelser var de samme for 275 BP-fragment.

alle amplifikationsprodukterne blev identificeret gennem vandret elektroforese i 2% agarosegeler farvet med 0,5 liter/ml ethidiumbromid og visualiseret med en UV-transilluminator.

til analyse af immunokromatografitest for hundeparvovirus (CPV Ag), anigen karit kit (Bionote Inc., Gyeonggi-do, Korea) blev udnyttet. Hver test blev udført efter producentens anvisninger.

blodprøver blev taget fra jugularvenen ved hjælp af vacutainer-rør med EDTA som antikoagulant. Komplette blodcelletællinger (CBC) blev udført ved hjælp af anautomeret celletæller. Mig, USA). Blodfilmene blev farvet med Vrig-Giemsa og undersøgt under et fotonikmikroskop. Leukopeni blev taget i betragtning, når et samlet CBC-antal var mindre end 6 liter 103/liter .

resultatanalyse blev udført ved brug af en matrice til kodede variabler , og beredskabstabeller blev oprettetat bestemme de diagnostiske testegenskaber . Desuden blev Kappa-statistikken bestemt til at vurdere aftalen mellem de tre anvendte tests og nPCR. Kappa-værdien blev karakteriseret ifølge Kantere og kolleger i 2015, hvorkappa-værdi 1 indikerer absolut enighed, mens en værdi på 0 indikerer, at aftale opstår på grund af tilfældighed. Generelt indikerer Kappa-værdier højere end 0,6 et godt aftaleniveau; analysen blev udført ved hjælp af den statistiske pakke SPSS Ver. 22.0 (IBM, Inc., Armonk, NY, USA).

Ninety one point one (91.1) % af positive hunde til CPV-2 af nPCR var renavlet; 95.5% af patienterne var mellem to og otte måneder gamle, og 4,5% var ældre end et år. Med hensyn til deres vaccinationsstatus blev 40% vaccineret mindst en gang for at forhindre CPV-2-infektion.

hyppigheden af kliniske tegn hos disse hunde var som følger: 44,4% havde opkastning og diarre; 20% havde feber, opkastning og diarre(katarral eller hæmoragisk); 17,7% viste kun diarre; 8,8% viste kun opkastning; og 4,4% havde diarre og feber, og 4,4% havde opkastning og feber.Leukopeni blev observeret hos 48,8% af hundene (tabel 1).

ved hjælp af klinisk undersøgelse diagnosticerede dyrlæger kun 57,8% af patienterne positive over for CPV-2 og 100% af de negative hunde; derfor blev følsomhedsværdien forklinisk diagnose estimeret til 57,7% (CI0.95 42,2–72), og den observerede specificitet var 100% (CI0.95 46,2–98,8).

hvad angår laboratorietestdiagnose, ud af 100% af hunde, der resulterede positivt gennem nPCR, var kun 30/45 af disse patienter CPV-2-positive gennemimmunokromatografitest, mens de fem kontrolpatienter, der testede negativt for CPV-2, blev korrekt diagnosticeret. Derfor viste denne teknik en følsomhedaf 66,6% (CI0,95 50,9–79,5), og den observerede specificitet var 100% (CI0,95 46,2–98,8).

ved anvendelse af PCR-teknik var 36/45 patienter positive over for CPV-2, og de fem kontrolpatienter blev bekræftet negative i hele nPCR. PCR viste således afølsomhed på 80% (CI0.95 63,1–87,7) og en specificitet på 100% (CI0.95 67,8–99,1) (Fig. 1).

enighed mellem de tre teknikker demonstreres gennem Kappa-værdien (tabel 2).

Gastroenteritis forårsaget af CPV – 2 betragtes som en af de vigtigste virussygdomme, der påvirker hunde. Selvom kliniske tegn på parvovirusinfektion hos hunde kan variere, er de mest almindelige tegn rapporteret: anoreksi, depression, sløvhed, feber ,mucoid og hæmoragisk diarre og leukopeni ; i subkliniske tilfælde er nogle af disse tegn måske eller måske ikke til stede .

under klinisk undersøgelse blev variabilitet i kliniske manifestationer af infektion observeret. Kun 20% af de undersøgte hunde præsenterede typiske tegn som almindeligtbeskrevet i litteraturen. Klinisk variabilitet for denne sygdom er blevet rapporteret tidligere, og nogle forfattere har diskuteret faktorer, såsom alder, immunstatus, eksponeringsvej, virusdosis, virulens af stammer og samtidig infektion medandre infektiøse agenser som mulige årsager . Dette komplicerer opnåelse af en nøjagtig diagnose af CPV-2, når dyrlæger udelukkende er afhængige af deres kliniske undersøgelse. Derfor, hvad angår voresundersøgelse udelukkende baseret på denne procedure vil 42,2% af hundene have en falsk-negativ CPV-2 diagnose.Gennem hunde medicinske journaler i denne undersøgelse observerede vi detdyrlæger udelukkede muligheden for infektion primært fordi hundene ikke udviste de klassiske kliniske tegn beskrevet i litteraturen, havde været vaccineret mod CPV-2 og/eller var voksne. Imidlertid viste de fleste hunde i vores undersøgelse atypiske tegn. Derfor mener vi, at subkliniske infektioneraf CPV – 2 er mere almindelige, og dyrlæger, der skal beslutte, om der skal anvendes yderligere diagnostiske tests med høj følsomhed og specificitet, børalvorligt overveje disse resultater.

i denne undersøgelse var 40% af patienterne positive over for CVP-2 tidligere blevet immuniseret. Det er velkendt, at PCR-teknik er meget følsom, og det detekterervaccine virale partikler i afføring fra nyligt vaccinerede patienter; undersøgelser viser, at det er muligt at opnå falske positive resultater fra dag 3 til 10postvaccination med en modificeret levende CPV-vaccine . Derfor at udføredenne undersøgelse blev patienter med vaccinationshistorie i de foregående 15 dage udelukket. Derudover blev prøver fra vaccinerede hunde, der var positive over for CPV-2,sekventeret, og i alle undersøgte tilfælde blev genovarianten CPV-2C identificeret (data viser ikke), hvilket indebærer, at hunde var inficeret med felt CPV-2C, vel vidende at der endnu ikke er nogen CPV-2cvaccine tilgængelig. Desuden rapporterede Pedrosa og kolleger, at den mest almindelige antigenvariant hos inficerede hunde var CPV-2C .

på den anden side overvejer mange dyrlæger tilstedeværelsen af leukopeni, en understøttende faktor for CPV-2 diagnose. Vi bemærkede dog, at kun 48.8% (22/45) af de undersøgte hunde præsenterede leukopeni under evalueringen, hvilket er i overensstemmelse med andre rapporter, der angav, at omkring 50% af hundene ikke viser hæmatologiskterationer på evalueringstidspunktet . Derfor er en CBC et værdifuldt værktøj, der kan give information omsygdomsgraden, hvilket tyder på en prognose og bestemmer responsen på behandlingen. Leukopeni bør dog ikke betragtes som et diagnostisk værktøj til CPV-2,fordi det ikke giver bevis for virustilstedeværelse.

forskellige teknikker til viral identifikation anvendes til den endelige bekræftelse af infektion med CPV-2, for eksempel hurtige tests baseret på immunokromatografier meget udbredt af klinikere, fordi proceduren er let, hurtig og tilgængelig. Derudover kræver det ikke prøveforberedelse eller afsendelse til en specialiseretlaboratorium til analyse. Den varierende følsomhed af denne test er dens ulempe; flere undersøgelser har vist , at dens følsomhed varierer fra 50 til 100%, og i vores undersøgelse var den komparative følsomhed med nPCR 66,6%. Nogle undersøgelser harforeslået, at den lave teknik følsomhed skyldes behovet for en stor viral partikler mængder, der skal kaste ind i afføringen af hunde for at opnå en positivdiagnose . Brugen af denne teknik skal genovervejes, da der forventes større sandsynlighed for falske negative resultater. For at forhindre dette skal der anvendes yderligere teknikker med højere følsomheder .

flere undersøgelser har vist den høje følsomhed af PCR-baserede tests; i øjeblikket er der flere varianter af samme procedure, der tilbyder følsomhederspænder fra 80 til 100% . I denne undersøgelse havde PCR 80% følsomhed, og det er bemærkelsesværdigt at nævne, at patienter kun blev identificeret positive over for infektion gennem nPCR i mellemtiden var hverken PCR eller immunokromatografitest i stand til at identificere det.

med hensyn til kappa-værdien sammenlignede vi resultater blandt de tre analyserede metoder til nPCR. Den dårlige aftale mellem klinisk diagnose og npcrblev ikke desto mindre demonstreret; moderat enighed blev observeret mellem konventionel PCR og nPCR, hvilket kan skyldes ligheden mellem de to tests.

hvad angår kliniske tegn blev der observeret enten opkastning eller diarre hos alle viralt inficerede patienter, mens andre kliniske tegn ikke blev anset for relevante for infektionen; i overensstemmelse med kliniske tegn og følsomhed af de anvendte teknikker blev der ikke observeret nogen sammenhæng. 26 kun opkastning som et klinisk tegn, og det blev anset for negativt for CPV-2 ved veterinær klinisk diagnose, men immunokromatografitest, PCR og nPCRtests var positive for CPV-2. Desuden kunne tilfælde 41 og 42, hvor det vigtigste kliniske tegn var diarre, kun diagnosticeres positivt over for CPV-2 ved hjælp af nPCR.

vores data viser, at de hyppigst anvendte diagnostiske tests i kliniske og diagnostiske veterinærlaboratorier til påvisning af CPV-2 er meget specifikke, men demanglende følsomhed, som forhindrer den præcise diagnose af CPV-2. I vores undersøgelse var PCR og immunochromatography test ikke så følsom som nPCR, hvilket blev bekræfteti tidligere undersøgelser er brugen af nPCR som diagnosetest endnu ikke udbredt på veterinærhospitaler , mens den stadig er meget anvendt til forskningsformål.

på den anden side bruges PCR i realtid, som også er meget følsom, sjældent på grund af dets høje udstyrsomkostninger og kravet om en meget specialiseretpersonale til håndtering. Teknologiske fremskridt gjorde det imidlertid muligt for disse teknikker at blive billigere og enklere at bruge, hvilket kunne føre til deres direkte anvendelse på veterinærhospitaler for at forbedre den diagnostiske nøjagtighed for CPV-2.