proteinrensningredit
Polyhistidin-tags anvendes ofte til affinitetsrensning af polyhistidin-mærkede rekombinante proteiner udtrykt i Escherichia coli og andre prokaryote ekspressionssystemer. Bakterieceller høstes via centrifugering, og den resulterende cellepellet lyseres enten ved fysiske midler eller ved hjælp af vaskemidler og f.eks. På dette stadium indeholder rålysat det rekombinante protein blandt mange andre proteiner, der stammer fra bakterieværten. Denne blanding inkuberes med en affinitetsharpiks indeholdende bundne divalente nikkel-eller koboltioner, som er kommercielt tilgængelige i forskellige sorter. Nikkel og kobolt har lignende egenskaber, og da de er tilstødende periode 4 overgangsmetaller (V. jerntriade). Disse harpikser er generelt sepharose/agarose funktionaliseret med en chelator, såsom iminodieddikesyre (Ni-IDA) og nitrilotrieddikesyre (Ni-NTA) for nikkel og Carboksyl-methyl aspartat (Co-CMA) for kobolt, som polyhistidin-tag binder med mikromolær affinitet. Ernst Hochuli et al. koblet 1987 NTA ligand og nikkel-ioner til agarose perler. Harpiksen vaskes derefter med fosfatbuffer for at fjerne proteiner, der ikke specifikt interagerer med kobolt-eller nikkelionen. Med Ni-baserede metoder kan vaskeeffektiviteten forbedres ved tilsætning af 20 mM imidasol (proteiner elueres normalt med 150-300 mM imidasol). Generelt har nikkelbaserede harpikser en højere bindingskapacitet, mens koboltbaserede harpikser tilbyder den højeste renhed. Renheden og mængden af protein kan vurderes ved SDS-PAGE og vestlig blotting.
Affinitetsrensning ved anvendelse af et polyhistidin-tag resulterer normalt i relativt rent protein, når det rekombinante protein udtrykkes i prokaryote organismer. Afhængig af nedstrøms applikationer, herunder oprensning af proteinkomplekser til undersøgelse af proteininteraktioner, oprensning fra højere organismer såsom gær eller andre eukaryoter kan kræve en tandem-affinitetsrensning ved hjælp af to tags for at give højere renhed. Alternativt giver enkelttrinsrensning ved anvendelse af immobiliserede koboltioner snarere end nikkelioner generelt en betydelig stigning i renhed og kræver lavere imidasolkoncentrationer til eluering af det his-mærkede protein.
Polyhistidin-tagging er valgmuligheden til rensning af rekombinante proteiner under denatureringsbetingelser, fordi dets virkningsmåde kun afhænger af den primære struktur af proteiner. For eksempel, selv når et rekombinant protein med magt udtrykt i E. coli producerer et inklusionslegeme og kan ikke opnås som et opløseligt protein, det kan renses med denaturering med urinstof eller guanidinhydrochlorid. Ved en høj pH binder histidin til nikkel eller kobolt, men ved lav pH (~6 for kobolt og ~4 for nikkel) bliver histidin protoneret og konkurreres ud af metalionen. Sammenlign dette med antistofrensning og GST-oprensning, en forudsætning, som er den korrekte (native) foldning af involverede proteiner. På den anden side siges det, at his-mærket har tendens til at samle og insolubilisere mere end andre affinitetskoder.
polyhistidin-tag kolonner bevarer flere velkendte proteiner som urenheder. En af dem er fkbp-type peptidylprolylisomerase, der vises omkring 25kda (SlyD). Urenheder elimineres generelt ved hjælp af en sekundær kromatografisk teknik eller ved at udtrykke det rekombinante protein i en SlyD-mangelfuld E. coli-stamme. Alternativt har sammenligning med nikkelbaserede koboltbaserede harpikser mindre affinitet med SlyD fra E. coli, men i flere tilfælde er det moderat nyttigt.
proteiner med forskellige antal polyhistidin-tags eluerer forskelligt fra nikkelaffinitetsharpiks. For proteiner med et enkelt geksahistidinmærke muliggør 75 mM eluering fra Ni-NTA, mens der for proteiner med to geksahistidinmærker kræves 100 mM til eluering. Denne trinvise eluering kan bruges til at isolere specifikke proteinsamlinger fra en blanding, såsom definerede heteromultimere (f.eks. en ab heterodimer fra en blanding inklusive AA-og BB-homodimere, hvis kun underenhed B har et polyhistidinmærke). En sådan fremgangsmåde blev anvendt i isolation af monovalent streptavidin.
Bindingsanalyseredit
Polyhistidin-tagging kan bruges til at detektere protein-protein-interaktioner på samme måde som en nedtrækningsanalyse. Imidlertid anses denne teknik generelt for at være mindre følsom og begrænses også af nogle af de mere finicky aspekter af denne teknik. For eksempel kan reducerende forhold ikke bruges, EDTA og mange typer vaskemidler kan ikke bruges. Nylige fremskridt inden for dobbelt polarisationsinterferometri er acceptabel for EDTA og en bredere anvendelse af reagenser, og brugen af sådanne stedspecifikke tags forenkler i høj grad den direkte måling af tilknyttet konformationsændring.
Geksahistadin cydye tags er også blevet udviklet. Disse bruger Nikkelkovalent koordinering til EDTA-grupper bundet til fluoroforer for at skabe farvestoffer, der fastgøres til polyhistidin-mærket. Denne teknik har vist sig at være effektiv til at følge proteinmigration og menneskehandel. Der har også været nylige opdagelser, der viser, at denne teknik kan være effektiv til at måle afstand via fluorescerende Resonansenergioverførsel.
et polyfluorohistidin tag er blevet rapporteret til brug i In vitro translationssystemer. I dette system anvendes en udvidet genetisk kode, hvor histidin erstattes af 4-fluorohistidin. Den fluorerede analog inkorporeres i peptider via den afslappede substratspecificitet af histidin-tRNA-ligase og sænker tagets samlede pKa. Dette muliggør selektiv berigelse af polyfluorohistidinmærkede peptider i nærvær af komplekse blandinger af traditionelle polyhistidinmærker ved at ændre vaskebuffernes pH.
