sammenligning mellem konventionel afkalkning og en mikrobølge-assisteret metode i knoglevæv påvirket med Mycetom

abstrakt

Mycetoma er en livslang granulomatøs sygdom i subkutane væv og knogler. Histopatologi er en underbygget vejledende metode baseret på antagelsen om en endelig diagnose af mycetom. Det kræver effektiv behandling af væv, herunder afkalkning af knogler. Afkalkningsprocessen skal sikre fuldstændig fjernelse af calcium og også en korrekt konservering af vævs-og mikroorganismers farvningsevne. Mål. At sammenligne den konventionelle metode, der anvendes til afkalkning, med mikrobølgemetoden ved hjælp af forskellige afkalkningsopløsninger. Forskellige egenskaber blev testet, herunder hastigheden af afkalkning og morfologisk og svampebevarelse i knoglevæv påvirket af mycetom. Materialer og metoder. Tre afkalkningsopløsninger blev anvendt til at fjerne calcium fra 50 knoglevævsprøver påvirket af mycetom, herunder 10% neutral bufret EDTA (pH 7,4), 5% salpetersyre og 5% saltsyre. Konventionelle og mikrobølgemetoder blev anvendt. Der blev anvendt en plet til at vurdere knogle-og svampemorfologier. Resultat. Afkalkningstiden for den konventionelle metode sammenlignet med mikrobølgemetoden med 10% EDTA (pH 7,4) tog 120 timer og 29 timer, mens 5% saltsyre og 5% salpetersyre tog 8 timer og 3 timer separat. 10% EDTA er også det bedste afkalkningsmiddel til HE-farvning og svampepletter. 5% saltsyre og 5% salpetersyre kan anvendes til svampefarvning. Konklusion. Den aktuelle undersøgelse undersøgte virkningerne af forskellige afkalkningsmidler samt to afkalkningsprocedurer på bevarelsen af knoglestrukturen og svampefarvning, som vil bidrage til at udvikle egnede protokoller til analyserne af knoglevævet påvirket af mycetominfektion.

1. Introduktion

Mycetoma er en livslang granulomatøs, gradvist skadelig epidemisk sygdom i huden og subkutane væv, der kan udvikle sig til dybere strukturer som muskler og knogler og føre til omfattende ødelæggelse, hovedsageligt af fødderne, der kræver brede lokale kirurgiske udskæringer eller amputation af lemmer . Mycetoma er defineret af triumviratet af ekspansion, udmattende bihuler og eksistensen af koloniale korn i de inflammatoriske ekssudater . Infektion er klassificeret som eumycetoma (svampeinfektion) eller actinomycetoma (bakteriel infektion) . Det er stort set en betingelse for tropiske og semitropiske regioner, mærkbart Sudan . Madurella mycetomatis afgrødekorn er enorme, spænder fra 0,5 til 3 mm, og vises afrundet, oval, eller trilobed. De består af kryds og tværs hyfer indgroet i interstitiel brunlig cement, der består af melaninlignende, sortbrunt pigment . Histopatologi er en hurtig vejledende metode såvel som fordelagtig proces under antagelse af en endelig diagnose af mycetomsygdom og inkluderer en rapport, der beskriver den morfologiske præsentation af de forårsagende midler. Det forårsagende middel kunne stadig isoleres fra det involverede knoglevæv . Afkalkning er et grundlæggende trin, der almindeligvis opnås til histopatologisk undersøgelse af knogler . Mineralerne i knogler består af calcium og fosfor, og uopløselige salte udgør mere end tres procent af knoglevæv . Disse mineraler giver knoglehårdhed og er årsagen til vanskeligheder under vævsskæring ved hjælp af roterende mikrotomer . Sådanne væv skal behandles for at ekstrahere calciumphosphat ved en procedure kendt som afkalkning ved at gøre vævet tilstrækkeligt delikat til at blive skåret af mikrotomet. Afkalkning opnås ved syrer, der danner opløselige calciumsalte eller chelateringsmidler, der binder til calciumioner. De nuværende konventionelle afkalkningsmetoder er kendetegnet ved besværlige processer og den vedvarende svigt i vævets farvningsreaktion . Ved den konventionelle afkalkningsmetode anbringes knoglevæv i en afkalkningsvæske ved stuetemperatur med ændringer af opløsningen med jævne mellemrum, indtil slutpunktet er nået. Mikrobølgeafkalkning er en innovativ teknik sammenlignet med den konventionelle metode . I denne proces anbringes faste væv i afkalkningsopløsningen i en mikrobølgeovn i periodiske varigheder med sædvanlige forskydninger af afkalkningsvæskerne, indtil slutpunktet er nået. Mikrobølgestråling er blevet udført for at fremskynde afkalkningsproceduren ca .Fra dage til timer. Formålet med denne undersøgelse var at sammenligne den konventionelle metode anvendt til afkalkning med den modificerede mikrobølgemetode ved anvendelse af forskellige afkalkningsopløsninger. Forskellige karakteristika blev testet, herunder afkalkningshastigheden og morfologisk og svampekonservering i knoglevæv påvirket af Madurella mycetomatis-infektion.

2. Materialer og metoder

dette er en eksperimentel beskrivende undersøgelse, der har til formål at sammenligne den konventionelle afkalkningsprocedure med mikrobølgeforstærket afkalkning med hensyn til vævsmorfologi påvirket af mycetominfektion ved hjælp af hæmatoksylin og eosin, Gridley og Grocott geksamin-sølvpletter til fuldstændig identifikation af madurella mycetomatis kausale organismer. Denne undersøgelse blev udført på Mycetoma Research Center i Soba Universitetshospital og fakultetet for medicinsk Laboratorievidenskab, University of Al Neelain. Der blev indhentet skriftligt informeret samtykke fra alle patienter. Halvtreds amputerede lemmer påvirket af mycetom blev opsamlet. Benbiopsier blev skåret ved hjælp af en passende sav i 5 mm tykke stykker og derefter fikseret i 10% formel saltvand i 48 timer. De blev vasket under rindende vand fra hanen i 30 minutter for at fjerne fikseringsmidlet.

2.1. Konventionel Afkalkningsprocedure

tre stykker 5 mm tykke sektioner af knoglebiopsier blev nedsænket i tre 250 ml Bægerbægre, der hver indeholdt 100 ml 5% vandig saltsyre (HCl), 5% vandig salpetersyre (HNO3) og 10% ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) anbragt ved stuetemperatur (gennemsnit 28 liter C), Se tabel 1. Afkalkningens slutpunkt blev kontrolleret ved hjælp af calciumoksalatmetoden for de to syredekalkningsmidler (5% HNO3 og 5% HCl) efter et to-timers interval som følger: 5 ml af den anvendte afkalkningsvæske blev taget og anbragt i et reagensglas, derefter blev lakmuspapir tilsat, og ammoniakhydroksid blev tilsat dråbe for dråbe, indtil lakmuspapiret skiftede, hvilket indikerer alkalisk pH-afkalkningsvæske var klar. 5 ml mættet ammoniumoksalatopløsning blev tilsat, når afkalkningsopløsningen blev uklar, hvilket indikerer tilstedeværelsen af calcium i knoglevæv, således at afkalkningsopløsningen blev erstattet med ny opløsning, og processen blev gentaget hvert 30.minut indtil afslutningen af afkalkningsprocessen. Til EDTA blev der anvendt fysisk afkalkningstest, hvor afkalkningsprocessen blev anset for at være afsluttet, når knoglen let blev gennemtrængt af en nål. De gennemsnitlige totale afkalkede tider var henholdsvis 7 timer og 30 minutter, 8 timer og 120 timer for henholdsvis 5% salpetersyre, 5% HCl og 10% EDTA.

2.2. Mikrobølgeprocedure

der blev anvendt en mikrobølgeovn (Midea mikroovn 20L, 700V, Digital, EM720CFF) med en fast roterende plade. Et glasbæger indeholdende 100 ml destilleret vand blev forvarmet i 5 sekunder for at opvarme magnetronen. Dette blev erstattet af 100 ml frisk destilleret vand og bestrålet for at opretholde temperaturen på omkring 41-43 liter C. Dette tog 15 sekunder. Glasbægeret blev tildelt på forskellige punkter i ovnen under bestråling for at løse den bedste placering af prøven under afkalkning af mikrobølgeovnen, da den anvendte mikrobølgeovn havde en konstant timing, men ikke en konstant temperatur. Tre stykker af 5 mm tykke sektioner af knoglebiopsier blev nedsænket i 250 ml Bægerbægre indeholdende 100 ml 5% vandig saltsyre (HCl), 5% vandig salpetersyre (HNO3) og 10% EDTA. Derefter blev de overført til mikrobølgeovnen, og prøverne blev bestrålet i ti cyklusser på ti sekunder hver (med 15 minutters intervaller) i en samlet tid på 2-4 timer for sure afkalkningsmidler (5% HNO3 og 5% HCl). Temperaturen af afkalkningsopløsningen blev opretholdt på omkring 41-43 liter C. afkalkningsopløsningen og afkalkningsendepunktet blev kontrolleret, og afkalkningsopløsningen blev gentagne gange ændret, indtil afkalkningen var afsluttet. Endepunktet for afkalkning blev kontrolleret ved hjælp af calciumoksalat og fysiske tests som nævnt. De gennemsnitlige totale afkalkede tider var henholdsvis 3 timer og 45 minutter, 5 timer og 30 minutter og 29 timer og 4 minutter for henholdsvis 5% salpetersyre, 5% HCl og 10% EDTA. Efter fuldstændig afkalkning blev vævene vasket under anvendelse af destilleret vand og overført til 0,3% ammoniakopløsning i 5 minutter for at neutralisere den anvendte syre.

2.3. Vævsbehandling og farvning

prøverne blev underkastet automatisk vævsbehandling ved hjælp af følgende protokoller: knoglebiopsierne blev anbragt i 10% formel saltvand i en time. Derefter, 50% alkohol en time, 70% alkohol en time, 90% alkohol en time, efterfulgt af 100% alkohol tre ændringer hver to timer hver, to ændringer, hver i en og en halv time, endelig paraffin voks to ændringer hver i to timer. Vævene blev indlejret i paraffinblokke og blev sektioneret til en tykkelse på 5-6 liter ved anvendelse af et roterende mikrotom. Sektioner blev farvet med Mayers hæmatoksylin, som beskrevet af Mayer i 1903, og kontrasten i hver var 1% eosin (HE) . Gridleys plet blev brugt til svampedemonstration som beskrevet af Gridley i 1953); efter deparaffinisering og rehydrering blev vævssektioner anbragt i 2% chromsyre i 30 minutter. De blev derefter vasket godt med ledningsvand, skyllet med destilleret vand og derefter anbragt i Schiffs reagens i 20 minutter. De blev derefter vasket i rindende vand fra hanen i 10 minutter og skyllet med 70% ethanol og derefter med 95% ethanol. De blev modfarvet med Metanil gul i et minut og skyllet godt med destilleret vand. Derefter blev de dehydreret i kylen og monteret i distyren, en blødgører og kylen. Derefter blev sektionerne undersøgt under et mikroskop . Grocott i 1955 blev anvendt, hvor sektioner blev iltet med 4% vandig kromsyre i en time, vasket i vand i et par sekunder, behandlet med 1% natriummetabisulfit i et minut, vasket i rindende vand fra hanen i 3 minutter, skyllet grundigt i destilleret vand, anbragt i forvarmet fungerende sølvopløsning i et vandbad ved 60 kg C i 20 minutter, skyllet godt i destilleret vand, vasket med rindende vand fra hanen i 5 minutter, modfarvet i arbejdslysegrøn i 15 sekunder, tørret og renset i Endelig undersøgt under et mikroskop.

2.4. Evaluering af resultater

sektioner blev evalueret af en eksperthistopatolog. Kvaliteten af afkalkningsproceduren og farvningsresultatet blev også vurderet og evalueret ved tommelfingerreglen, og kvaliteten af afkalkning blev evalueret efter følgende kriterier: tidspunktet for afkalkning, den morfologiske bevarelse af vævsmorfologi og madurella mycetomatis svampe af HE; Gridley og Grocott methenamin-sølvfarvning blev klassificeret fra 1 til 4 (1: dårlig, 2: retfærdig, 3: god og 4: fremragende) .

2.5. Statistisk analyse

dataanalyse blev udført ved hjælp af SPSS-programmet. Envejs ANOVA blev brugt til at bevise effekten af de tre afkalkningsløsninger på den kvantitative analyse af sektionskvalitet og svampebevarelse. Kruskal-væg-testen blev udført for at bestemme, om der var en signifikant forskel mellem de testede opløsninger for hver af de parametre, der blev evalueret sammen med de to eksperimenter. Forskelle med blev fortolket som værende statistisk signifikante.

3. Resultater

halvtreds tilfælde af Madurella mycetomatis med sort korn blev inkluderet i undersøgelsen. Fødderne var den mest berørte anatomiske region i 48 tilfælde (96%) og to tilfælde (4,0%) i hånden. Med hensyn til afkalkningstidspunktet i forskellige eksperimenter tog afkalkning med 10% EDTA (pH 7,4) blandt de tre testede opløsninger den længste tid for den konventionelle metode (op til 120 timer sammenlignet med 29 timer med mikrobølgeovnen), og brugen af en syre-afkalkningsopløsning tog den korteste tid fra 8 timer til 3 timer for forskellige afkalkningsmetoder. Kvaliteten af vævsmorfologi af forskellige typer afkalkningsopløsning ved hjælp af afkalkningsmikrobølgemetoden sammenlignet med den konventionelle metode med Mayers hæmatoksylin-og eosin-farvning med hensyn til nukleart og cytoplasmatisk udseende opnåede variable resultater. Også 10% EDTA-afkalket knogle syntes at have et signifikant overlegen resultat (P-værdi ved anvendelse af chi-kvadratprøve: 0,023) sammenlignet med 5% HNO3 og 5% HCl. Fremragende farvning rapport var 43 (86%) versus 32 (64%), 42 (84%) henholdsvis 18 (36%) og 33 (66%) versus 1 (2%). Grocott methenamine-silver stain-metoden blev anvendt til demonstration af Madurella mycetomatis-årsagsmidlet vedrørende svampes morfologi og lysstyrke, og vævssektioner afkalket med 10% EDTA, 5% HNO3 og 5% HCI ved anvendelse af konventionelle og mikrobølgemetoder viste signifikant bedre svampemorfologi (P-værdi ved anvendelse af chi-kvadratprøve: 0,001) som følger: 33 (66%) versus 32 (64%), 33 (66%) henholdsvis 39 (78%) og 22 (44%) versus 31 (62%). Den anden svampefarve, der blev brugt til Madurella mycetomatis, var Gridley-plet vedrørende svampemorfologi og farvningskvalitet af knogler afkalket med 10% EDTA, 5% HNO3 og 5% HCl ved hjælp af de konventionelle metoder og mikrobølgemetoder, som viste signifikant bedre fund (P-værdi ved hjælp af chi-kvadratprøve: 0,003) som følger: 43 (86%) versus 41 (82%), 32 (64%) henholdsvis 34 (68%) og 23 (46%) versus 35 (70%). Disse resultater er opsummeret i tabel 2. Figur 1 viser farvningsresultaterne ved hjælp af forskellige afkalkningsmidler og betingelser.

Figur 1

Demonstration af farvningsresultater ved hjælp af forskellige afkalkningsmidler og betingelser.

4. Diskussion

den histopatologiske identifikation af det forårsagende middel til Madurella mycetomatis er veletableret, da det er guldstandardproceduren; hårdt væv og knogler kræver dog særlig afkalkning for at bevare vævsstrukturen og det forårsagende middels morfologi. De forårsagende midler kan identificeres ved hjælp af hæmatoksylin og eosin (HE) og svampe specielle pletter, så knoglen kræver en standard afkalkningsprotokol, der bevarer væv, årsagsmiddelmorfologi og pletevne. Bone afkalkning er en kedelig teknik. Det kræver uger, og bevarelse af vævskonfigurationen afhænger af kvaliteten og hastigheden af afkalkningsproceduren. En ny proces ved hjælp af en mikrobølgeovn blev realiseret for at fremskynde afkalkningsprocessen . Valget af afkalkningsmiddel og måde bestemmes grundlæggende af metodens alvor , og de mulige anvendelser af mikrobølgeenergi i histologiske teknikker blev først dokumenteret af Mayers i 1970. Dette system med ikke-ioniserende emissionsmetode menes at fremskynde afkalkningsprocessen . Den molekylære kinetik forårsager derefter produktionen af energiændring, som varer, indtil strålingen stopper . I denne undersøgelse var afkalkningstider rapporteret for mikrobølgeforbedret afkalkning og den konventionelle afkalkningsprocedure 29 og 120 timer med henholdsvis 10% EDTA (pH 7,4), tre timer og syv timer med 5% salpetersyre og fem og otte timer med 5% HCl. Det er klart, at mikrobølgeafkalkningsmetoden for knoglevæv påvirket af mycetominfektion var signifikant hurtigere end den konventionelle metode. Også 5% salpetersyre havde hurtigere afkalkningsevne efterfulgt af 5% saltsyre og derefter EDTA (pH 7,4) for begge metoder. Pitol et al. brugte en mikrobølgeovn til fjernelse af calcium i rottebenet med 8,5% EDTA-opløsning og viste et fald i prøveperioden fra 45 dage i den konventionelle proces til 48 timer i den mikrobølge-assisterede proces. I dette arbejde tog 10% EDTA-opløsningen 120 timer i den konventionelle metode og 29 timer ved hjælp af mikrobølger for at opnå fuldstændig afkalkning af knoglevævet påvirket af mycetominfektion. Koncentrationen af EDTA i vores eksperiment var mere end Pitol et al.s undersøgelse. Ud over forskelle i størrelse, tykkelse og typer af knoglen kan disse være mulige forklaringer på stigningerne i afkalkningstiden i Pitol et al.s undersøgelse, der blev reduceret i vores omgivelser. Desuden tog afkalkning af knoglen påvirket af mycetominfektion med den konventionelle metode ved anvendelse af 5% salpetersyre syv timer, mens mikrobølgeovnsmetoden tog tre timer. Balaton og Loget opnåede sammenlignelige resultater . Desuden blev afkalkningstider i denne forskning reduceret fra andre undersøgelser. De afkalkningstider, der er rapporteret for konventionelle metoder og mikrobølgemetoder, varierede fra en dag og fire timer til 5 dage og betragtes som lave sammenlignet med andre undersøgelser i gnaverbenet, som har rapporteret gange mellem 2 og 7 dage med syre-afkalkningsopløsninger og henholdsvis 10% EDTA (pH 7,4). Shibata og hans gruppe rapporterede næsten lignende afkalkningstider, der varierede fra 1 dag til 7 dage med 10% HCl, 10% salpetersyre og 10% EDTA. De brugte imidlertid syre decalcifiers med højere koncentrationer . Uma et al. evaluerede virkningerne af fire forskellige afkalkningsvæsker ved hjælp af mikrobølgeafkalkning i rottebenet og rapporterede 1 til 1,5 dage for 5% salpetersyre og 7% HCl/2% EDTA. Imidlertid tog 10% EDTA 14 til 26 dage alt efter knogletypen . I disse undersøgelser varierede knogletypen, naturen og størrelsen og adskilte sig fra dem, der blev analyseret her. Afkalkningsproceduren var en vigtig årsag til overlegenheden af vævssektionen og præcisionen af farvning. Philipp et al. (2019) beskrev, at afkalkningsmetoden forårsager signifikante morfologiske ændringer, der ændrer proteinstrukturen og påvirker vævets farvningsevne . I vores undersøgelse blev knoglen behandlet med 5% salpetersyre med den rutinemæssige manuelle metode, og der var hævelse i blødt væv og tab af nuklear og svampefarvning sammenlignet med mikrobølge-assisteret afkalkning. Syre-afkalkningsmidler forstyrrer normalt knogle-og blødt vævskonstans. Disse specielle effekter i 5% salpetersyre er på grund af den periode, der er taget, og surhedsgraden af opløsningen. Således vil hurtigere afkalkning forårsage større skade og større effekter i H&E og svampe speciel plet. Flere svampe kan demonstreres med et histologisk afsnit ved hjælp af histokemiske pletter såsom Grocott ‘ s methenamin-sølv (GMS) plet og/eller Gridley (GS) plet . Nogle svampe kan nøjagtigt demonstreres i væv baseret på morfologiske strukturer; genkendelseseffektiviteten havde imidlertid en tendens til at aftage efter langvarig fiksering og afkalkning ved hjælp af konventionelle metoder . I denne undersøgelse gav mikrobølge-assisteret afkalkning overlegen farvning sammenlignet med den konventionelle metode til morfologi ved anvendelse af H&E og svampespeciel plet, hvor 10% EDTA var den løsning, der bedst bevarede vævsstrukturer og svampefarvningsevne på trods af at det tog lang tid for afkalkning.

5. Konklusion og anbefalinger

afkalkning forbedret ved brug af en mikrobølgeovn er en ny teknik til afkalkning. Denne teknik blev undersøgt i knoglevæv påvirket af Madurella mycetomatis-infektion ved anvendelse af 10% EDTA, 5% salpetersyre og 5% saltsyre som afkalkningsvæsker. Dette blev sammenlignet med konventionel afkalkning ved stuetemperatur for at bestemme hastigheden af afkalkning og vævsmorfologi ved hjælp af Mayers hæmatoksylin-og eosin-plet til knoglestrukturen og Grocott-og Gridley-pletter til svampemorfologi. Bedre resultater blev opnået sammenlignet med den konventionelle metode både i cellemorfologi og svampespore og hyfer med nedsat svampelysstyrke ved stuetemperatur. Dette fund kan hjælpe med at udvikle egnede protokoller til analyser af knoglevæv påvirket af mycetominfektion.

6. Begrænsninger af den nuværende undersøgelse

en større stikprøvestørrelse ville have givet mere afgørende resultater. Også de tidspunkter, der er taget til afkalkning, vil sandsynligvis være forskellige, hvis der anvendes forskellige knoglevægte og andre knogleprøver end hænder, da afkalkningstiden afhænger af størrelsen og den strukturelle tæthed af det hårde væv. Endelig, da vi har brugt en indenlandsk mikrobølgeovn, kan vores temperaturoptagelser kun have været omtrentlige.

datatilgængelighed

datasættene genereret under den aktuelle undersøgelse er tilgængelige fra den tilsvarende forfatter på rimelig anmodning.

etisk godkendelse

denne undersøgelse blev godkendt af det institutionelle Gennemgangsudvalg for det medicinske Laboratorievidenskab, University of Al Neelain.

interessekonflikter

forfatteren erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikter.

anerkendelser

forfatteren ønsker at udtrykke sin oprigtige taknemmelighed til personalet på Mycetoma Research Center, University of Khartoum, Khartoum, Sudan, og særlig påskønnelse til professorer Ahmed Hassan Fahal og Ahmed Mohammed El Hassan, emeritus professor i patologi, for deres hjælp.

supplerende materialer

de materialer og reagenser, der anvendes til at understøtte resultaterne af denne undersøgelse, er inkluderet i de supplerende oplysninger. (Supplerende Materialer)