TUNEL-analysen bruges mest til at detektere celler, der gennemgår apoptose, som er en form for programmeret celledød. Apoptose er en vigtig biologisk proces under udvikling og til opretholdelse af vævshomeostase. TUNEL farvning giver mulighed for visualisering og kvantificering af apoptotiske celler. Dette hjælper forskere med at teste effektiviteten af nye behandlinger for lidelser, hvor apoptose enten hæmmes, som i kræft eller forbedres, som i neurodegeneration.
denne video forklarer, hvordan TUNEL-analysen kan bruges til at mærke celler, der gennemgår apoptose, en trinvis protokol til udførelse af denne metode i vævssektioner, og hvordan forskere anvender denne teknik til at forstå mekanismer for celledød.
før vi går ind i protokollen til TUNEL-analysen, lad os diskutere principperne bag denne teknik.
et af de mange kendetegn ved apoptose er DNA-fragmentering. Hvordan forekommer DNA-fragmentering? Apoptose udføres af caspaser, der er til stede i cytosolen. Deres primære rolle er at spalte proteiner for at demontere cellen. Derudover aktiverer caspaser et kaldet caspase-aktiveret DNase eller CAD ved at løsne det fra dets hæmmer—ICAD. Aktiveret CAD er en endonuklease, der bevæger sig til kernen og spalter kromosomalt DNA.
spaltning af DNA forårsager i sidste ende akkumulering af DNA-fragmenter med hakkede ender, og TUNEL-analysen mærker fluorescerende disse hakkede ender af fragmenteret DNA, så forskere kan opdage apoptose. Men hvordan sker det? For det er du nødt til at forstå TUNEL-reaktionen. TUNEL står for dUTP nick-end mærkning. De to vigtigste Tunel-reagenser er terminale deoksynukleotidyltransferase, eller TdT, og deoksyuridintrifosfat, eller dUTP, som kan være fluorescerende mærket for at lette påvisning.
for at forstå TUNEL-reaktionen, lad os gå tilbage til de apoptotiske celler med DNA-fragmenter. Disse hakkede fragmenter har frie 3 ‘ hydroksyl grupper. Når du har tilføjet TUNEL-reagenserne til en prøve, der indeholder apoptotiske celler, fastgøres de fluorescerende mærkede dutp’ er til disse 3 ‘ hydroksyl-grupper ved hjælp af katalysatoren TdT. Cellerne, der farves ved hjælp af denne procedure, kaldes TUNEL-positive celler, som derefter kan visualiseres ved hjælp af fluorescensmikroskopi.
nu hvor du forstår de grundlæggende principper og begreber bag TUNEL-analysen, lad os skitsere en generel protokol til udførelse af denne teknik i vævssektioner. De vigtigste trin i TUNEL-analysen inkluderer fastgørelse af vævet af interesse, permeabilisering af vævet, tilsætning af TUNELREAGENSER, standsning af TUNEL-reaktionen og endelig analysen.
for det første skal vævet af interesse fastgøres for at bevare biologiske strukturer. Fiksering virker ved at tværbinde proteiner i celler. Til TUNEL-analysen kan væv fastgøres ved at tilsætte dem til en opløsning indeholdende 4% paraformaldehyd i 4-24 timer ved 4 liter C. Efter fiksering kryosektion vævet i tynde skiver på 10 liter eller mindre.
det næste trin er permeabilisering, som gør det muligt for reagenser som f.eks. Permeabilisering af vævssektioner kan udføres ved at tilsætte vævet til proteinase K-opløsning i 5-15 minutter ved 37 liter C. skyl vævssektioner med fosfatbufret saltvand på en orbitalryster i 15-30 minutter ved stuetemperatur.
efter permeabilisering tilsættes TDT og fluorescerende mærkede dutp ‘ er til vævssektionerne sammen med en mærkningsbuffer indeholdende kobolt, der fungerer som en cofaktor for TUNEL-reaktionen. Sammen inkuberes TUNEL-reaktionsblandingen og vævssektionen i 1-3 timer ved 37 liter C og beskyttes mod lys for at forhindre fluorescensen i at falme.
efter inkubation sættes stopbuffer til vævssektionen for at stoppe TUNEL-reaktionen, og efter en kort inkubation vaskes sektionerne med fosfatbufret saltvand. Endelig visualiseres vævssektioner farvet ved hjælp af fluorescerende mærket dUTP ved hjælp af fluorescensmikroskopi og vurderes for lokalisering af TUNEL-positive celler i et givet væv. Man kan kvantificere celledød ved blot at tælle procentdelen af TUNEL-positive celler i en given vævssektion.
nu hvor du har set, hvordan du udfører TUNEL-analysen for at opdage apoptotiske celler, lad os diskutere, hvordan dette assay kan bruges til at adressere spørgsmål stillet af cellebiologer.
celledød forekommer som en normal del af udviklingen til skulptur af væv og strukturer og til eliminering af unødvendige celler. Derfor studerer forskere, der er interesseret i dette fænomen, effekten af prænatal eksponering for forskellige stoffer på apoptose under udvikling. Her var forskere interesserede i at undersøge effekten af prænatal alkoholeksponering på hjernens udvikling. Resultaterne af TUNELFARVNING udført på føtal hjerner afslørede øget apoptose i væv, der blev prenatalt udsat for alkohol sammenlignet med kontroldyr.
forskere bruger også TUNEL-analysen til at undersøge apoptose som reaktion på bakteriel infektion. I dette eksperiment udviklede forskere en model for lungebetændelse ved at injicere mus med Pseudomonas aeruginosa, som inducerer lungebetændelse. Derefter blev lungevæv fjernet, og TUNELFARVNING blev udført for at undersøge apoptose som reaktion på bakterieinfektionen. Resultaterne viser, at apoptotisk celledød steg hos mus udsat for bakterierne sammenlignet med kontroldyr.
endelig kan TUNELFARVNING anvendes på humane tumorprøver for at bestemme tumorresponsivitet over for lægemidler. I dette eksempel blev tumorprøver høstet fra humane patienter og dyrket eks vivo. Derefter blev de behandlet med prækliniske lægemidler og vurderet for et respons ved hjælp af TUNEL-analysen. Data opnået viser, at behandling med et lægemiddel, der hæmmer varmechokprotein 90, signifikant øger apoptose i tumorvæv.
du har lige set JoVE ‘ s video om at bruge TUNEL-analysen til at detektere celler, der gennemgår apoptose. Denne video gennemgik principperne bag TUNELFARVNING og en trinvis protokol til at udføre TUNEL-analysen på vævssektioner. Vi gennemgik også, hvordan denne metode kunne anvendes til at forstå programmeret celledød under udvikling og sygdom. Som altid, tak for at se!
