Der TUNEL-Assay wird am häufigsten zum Nachweis von Zellen verwendet, die sich einer Apoptose unterziehen, einer Form des programmierten Zelltods. Apoptose ist ein wichtiger biologischer Prozess während der Entwicklung und zur Aufrechterhaltung der Gewebehomöostase. Die TUNEL-Färbung ermöglicht die Visualisierung und Quantifizierung apoptotischer Zellen. Dies hilft Wissenschaftlern, die Wirksamkeit neuer Behandlungen für Erkrankungen zu testen, bei denen die Apoptose entweder wie bei Krebs gehemmt oder wie bei Neurodegeneration verstärkt wird.
In diesem Video wird erläutert, wie der TUNEL-Assay zur Markierung von Zellen verwendet werden kann, die sich einer Apoptose unterziehen, ein schrittweises Protokoll für die Durchführung dieser Methode in Gewebeschnitten und wie Forscher diese Technik anwenden, um Mechanismen des Zelltods zu verstehen.
Bevor wir uns mit dem Protokoll des TUNEL-Assays befassen, wollen wir die Prinzipien hinter dieser Technik diskutieren.
Eines der vielen charakteristischen Merkmale der Apoptose ist die DNA-Fragmentierung. Wie erfolgt die DNA-Fragmentierung? Apoptose wird durch Enzyme durchgeführt, die Caspasen genannt werden, die im Cytosol vorhanden sind. Ihre Hauptaufgabe besteht darin, Proteine zu spalten, um die Zelle abzubauen. Darüber hinaus aktivieren Caspasen ein Enzym namens Caspase-aktivierte DNase oder CAD, indem sie es von seinem Inhibitor—ICAD – lösen. Aktiviertes CAD ist eine Endonuklease, die zum Kern wandert und chromosomale DNA spaltet.
Die Spaltung von DNA führt letztendlich zur Ansammlung von DNA-Fragmenten mit eingekerbten Enden, und der TUNEL-Assay markiert diese eingekerbten Enden fragmentierter DNA fluoreszierend, sodass Wissenschaftler Apoptose nachweisen können. Aber wie passiert das? Dafür müssen Sie die TUNEL-Reaktion verstehen. TUNEL steht für terminal desoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end marking. Die beiden wichtigsten TUNEL-Reagenzien sind terminale Desoxynukleotidyltransferase oder TdT und Desoxyuridintriphosphat oder dUTP, die zur Erleichterung des Nachweises fluoreszenzmarkiert sein können.
Um die TUNEL-Reaktion zu verstehen, gehen wir zurück zu den apoptotischen Zellen mit DNA-Fragmenten. Diese gekerbten Fragmente haben freie 3′-Hydroxylgruppen. Sobald Sie die TUNEL-Reagenzien zu einer Probe hinzufügen, die apoptotische Zellen enthält, binden die fluoreszenzmarkierten dUTPs mit Hilfe des Katalysatorenzyms TdT an diese 3′-Hydroxylgruppen. Die mit diesem Verfahren gefärbten Zellen werden als TUNEL-positive Zellen bezeichnet, die dann mittels Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht werden können.
Nachdem Sie nun die grundlegenden Prinzipien und Konzepte hinter dem TUNEL-Assay verstanden haben, möchten wir ein allgemeines Protokoll für die Durchführung dieser Technik in Gewebeschnitten skizzieren. Die Hauptschritte des TUNEL-Assays umfassen die Fixierung des interessierenden Gewebes, die Permeabilisierung des Gewebes, die Zugabe von TUNEL-Reagenzien, das Stoppen der TUNEL-Reaktion und schließlich die Analyse.
Zunächst muss das interessierende Gewebe fixiert werden, um biologische Strukturen zu erhalten. Die Fixierung funktioniert durch Vernetzung von Proteinen in Zellen. Für den TUNEL-Assay können Gewebe fixiert werden, indem sie zu einer Lösung mit 4% Paraformaldehyd für 4-24 Stunden bei 4 ° C gegeben werden.
Der nächste Schritt ist die Permeabilisierung, die es Reagenzien wie dem TdT-Enzym ermöglicht, in den Zellkern einzudringen. Die Permeabilisierung von Gewebeschnitten kann durch Zugabe des Gewebes zu Proteinase-K-Lösung für 5-15 Minuten bei 37 ° C durchgeführt werden. Spülen Sie Gewebeschnitte mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung auf einem Orbitalschüttler für 15-30 Minuten bei Raumtemperatur.
Nach der Permeabilisierung werden das TdT-Enzym und fluoreszenzmarkierte dUTPs zusammen mit einem Markierungspuffer, der Kobalt enthält, das als Cofaktor für die TUNEL-Reaktion wirkt, zu den Gewebeschnitten gegeben. Zusammen werden das TUNEL-Reaktionsgemisch und der Gewebeschnitt 1-3 Stunden bei 37 °C inkubiert und vor Licht geschützt, um ein Ausbleichen der Fluoreszenz zu verhindern.
Nach der Inkubation wird dem Gewebeabschnitt Stoppuffer zugegeben, um die TUNELREAKTION abzubrechen, und nach kurzer Inkubation werden die Abschnitte mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen. Schließlich werden mit fluoreszenzmarkiertem dUTP gefärbte Gewebeschnitte unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie visualisiert und auf Lokalisation von TUNEL-positiven Zellen innerhalb eines bestimmten Gewebes untersucht. Man kann den Zelltod einfach quantifizieren, indem man den Prozentsatz der TUNEL-positiven Zellen in einem bestimmten Gewebeabschnitt zählt.
Nachdem Sie nun gesehen haben, wie Sie den TUNEL-Assay zum Nachweis apoptotischer Zellen durchführen, wollen wir diskutieren, wie dieser Assay verwendet werden kann, um Fragen von Zellbiologen zu beantworten.
Der Zelltod tritt als normaler Teil der Entwicklung auf, um Gewebe und Strukturen zu formen und unnötige Zellen zu eliminieren. Daher untersuchen Wissenschaftler, die an diesem Phänomen interessiert sind, die Wirkung der pränatalen Exposition gegenüber verschiedenen Substanzen auf die Apoptose während der Entwicklung. Hier waren Wissenschaftler daran interessiert, die Wirkung der pränatalen Alkoholexposition auf die Gehirnentwicklung zu untersuchen. Die Ergebnisse der TUNEL-Färbung an fötalen Gehirnen zeigten eine erhöhte Apoptose in Geweben, die pränatal Alkohol ausgesetzt waren, im Vergleich zu Kontrolltieren.
Wissenschaftler verwenden den TUNEL-Assay auch, um die Apoptose als Reaktion auf eine bakterielle Infektion zu untersuchen. In diesem Experiment entwickelten Wissenschaftler ein Modell der Lungenentzündung, indem sie Mäusen Pseudomonas aeruginosa injizierten, das eine Lungenentzündung induziert. Dann wurde Lungengewebe entfernt und eine TUNEL-Färbung durchgeführt, um die Apoptose als Reaktion auf die bakterielle Infektion zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigen, dass der apoptotische Zelltod bei Mäusen, die den Bakterien ausgesetzt waren, im Vergleich zu Kontrolltieren zunahm.
Schließlich kann die TUNEL-Färbung an menschlichen Tumorproben verwendet werden, um die Tumorreaktion auf Arzneimittel zu bestimmen. In diesem Beispiel wurden Tumorproben von menschlichen Patienten entnommen und ex vivo kultiviert. Als nächstes wurden sie mit präklinischen Medikamenten behandelt und mit dem TUNEL-Assay auf ein Ansprechen untersucht. Die erhaltenen Daten zeigen, dass die Behandlung mit einem Medikament, das das Hitzeschockprotein 90 hemmt, die Apoptose im Tumorgewebe signifikant erhöht.
Sie haben gerade Joves Video über die Verwendung des TUNEL-Assays zum Nachweis von Zellen, die sich einer Apoptose unterziehen, gesehen. In diesem Video wurden die Prinzipien der TUNEL-Färbung und ein schrittweises Protokoll zur Durchführung des TUNEL-Assays an Gewebeschnitten erläutert. Wir haben auch überprüft, wie diese Methode angewendet werden könnte, um den programmierten Zelltod während der Entwicklung und Krankheit zu verstehen. Wie immer, danke fürs Zuschauen!
