Schiebeklemmen finden sich in allen Bereichen des Lebens und sind essentiell für eine effiziente DNA-Replikation, die bei jeder Zellteilung erforderlich ist, sowie für die Koordination des DNA-Verkehrs. Die Escherichia coli (E. coli) Beta‐Clamp ist ein ringförmiges Protein, das aus zwei identischen Monomeren besteht, die vom dnaN-Gen kodiert werden, das mit der DNA-Polymerase III assoziiert ist und den für die DNA-Replikation erforderlichen hohen Prozessivitätsgrad ermöglicht. Schiebe-Clamp-Proteine öffnen sich und werden durch Clamp-Loader in Gegenwart von ATP auf spezifische DNA-Strukturen geladen. Wir wollen Einblicke in die Beiträge verschiedener Domänen zur Funktion von Beta gewinnen, indem wir eine Linked‐Beta‐Klemme verwenden, die das Homodimer an einer von zwei Schnittstellen einschränkt. Normalerweise ermöglicht die homo-dimere Struktur der Beta-Klemme, dass sie als molekularer Werkzeuggürtel fungiert und mehr als ein Protein gleichzeitig an bestimmten Proteinwechselwirkungsstellen an der Klemme bindet. So wird ein besseres Verständnis der Rolle der gleitenden Klammern im Prozess der DNA-Schadenstoleranz gesammelt, indem untersucht wird, ob eine Grenzfläche oder Bindungsstelle für die DNA-Beladung oder für andere Proteininteraktionen ausreichend ist. Um dieses Konstrukt zu erstellen, wurden die Linkerlänge und -sequenz sowie die Expressionsbedingungen optimiert. Die Linked-Beta-Proteine wurden durch einen thermischen Denaturierungsassay charakterisiert und zeigten eine vergleichbare thermische Stabilität wie Wildtyp‐Beta. In einem ATPase-Assay wurden ähnliche Mengen an anorganischem Phosphat in Reaktionen nachgewiesen, die entweder Linked‐Beta oder Wildtyp‐Beta enthielten, was darauf hinweist, dass der Clamp-Loader mit beiden Versionen der Beta-Klemme interagieren kann. Derzeit untersuchen wir, ob verknüpftes und Wildtyp‐Beta die Prozessivität einer Polymerase in einem Primer-Extension-Assay verbessern. Wir konstruieren und charakterisieren jetzt Varianten von Wildtyp-Beta und Linked‐Beta, um die Bedeutung von Resten an nur einer der Grenzflächen oder Partnerproteinbindungsstellen zu testen.
