10.4.2 Trehalose zur Kryokonservierung von Säugetierzellen
Die Kryokonservierung wurde häufig zur Konservierung von Zellen über längere Zeiträume bei extrem niedrigen Temperaturen eingesetzt. Körperliche Veränderungen, die während des Einfrierens und Auftauens auftreten, können jedoch das Überleben und die Funktionen der Zellen beeinträchtigen. Daher müssen den Zellen während der Kryokonservierung Kryoprotektoren zugesetzt werden. Die Verwendung von Trehalose als Kryoprotektor für Zellen entstand aus der Vorstellung, dass Polyhydroxyverbindungen auf beiden Seiten der Zellmembran erforderlich sind, damit die Zellen für längere Zeiträume konserviert werden können . Trehalose wurde von mehreren Gruppen als Schutzmittel für die Kryokonservierung verschiedener menschlicher Zellen untersucht.
Beattie et al. einführung von Trehalose zusammen mit DMSO in pankreatische Langerhans-Zellen unter Verwendung eines thermotropen Flüssigphasenübergangs . Die Kryokonservierung mit Trehalose führte zu einer 92% igen Erholung der adulten Inseln, verglichen mit nur 58% Erholung mit DMSO allein. In den Transplantaten von mit Trehalose kryokonservierten Inseln wurde vierzehnfach mehr Insulin gefunden als in solchen ohne Trehalose. Die Rückgewinnung von menschlichen fetalen inselartigen Zellclustern (ICCs), die mit Trehalose kryokonserviert wurden, betrug 94%, verglichen mit nur 42% für diejenigen ohne Trehalose. Bei der Transplantation in Nacktmäuse wurde ein 15-facher Anstieg des Insulingehalts von Transplantaten aus mit Trehalose kryokonservierten Zellen beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Zugabe von Trehalose als Kryokonservierungsmittel zu sehr hohen Überlebensraten des menschlichen endokrinen Pankreasgewebes führt.
Toner und Mitarbeiter führten niedrige Konzentrationen von Trehalose in Säugetierzellen ein, indem sie eine gentechnisch veränderte Version des porenbildenden Proteins Alpha-Hämolysin verwendeten, und fanden heraus, dass intrazelluläre Trehalose das Überleben dieser Zellen während der Kryokonservierung erheblich verbessern kann . Die langfristigen Überlebensraten nach dem Auftauen von kryokonservierten Mausfibroblasten und humanen Keratinozyten betrugen 80% bzw. 70% bei einer intrazellulären Trehalosekonzentration von 0,2 M. Es wurde auch festgestellt, dass intrazelluläre Trehalose eine positive Wirkung auf die Membranintegrität getrockneter Säugetierzellen hat, wobei beim Trocknen und Lagern der Zellen unter milden Bedingungen für mehrere Wochen eine Erholung der intakten Plasmamembran von mehr als 90% beobachtet wurde .
Die Wirkung von Trehalose auf die Kryokonservierung humaner Hepatozyten wurde von Katenz et al. . Leberzellen, die in Kulturmedium mit 10% DMSO und 0,2 M Trehalose eingefroren wurden, zeigten im Vergleich zu DMSO allein eine signifikante Verbesserung der Lebensfähigkeit der Zellen nach dem Auftauen und der Plattierungseffizienz. Das Vorhandensein von Trehalose während der Kryokonservierung führte auch zu einem erhöhten Gesamtproteinspiegel in den anhaftenden Zellen, höheren Albuminsekretionsniveaus und niedrigeren Aspartatamintransferasespiegeln nach dem Auftauen.
Stammzellen sind wichtige Werkzeuge zur Untersuchung der Hämatopoese, zur Entwicklung neuartiger Therapiestrategien sowie als Modellsysteme für bestimmte Krankheiten. Trotz der Entwicklungen in der Kryokonservierung bleibt der Zelltod nach dem Auftauen ein großes Problem. In: Martinetti et al. verwendete Trehalose, um reine hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen aus peripherem Blut zu kryokonservieren, um Zellverlust zu verhindern, der während des normalen Verlaufs der Kryokonservierung auftritt . Die Expression des Oberflächenstammmarkers CD34 wurde ausgewertet, und es wurde festgestellt, dass 1 M Trehalose einen verbesserten Kryoschutz für CD34 + -Zellen mit höherer Zellzahl und Zelllebensfähigkeit im Vergleich zur Standard-Gefriermethode unter Verwendung von DMSO bietet. Darüber hinaus behielt die Kryokonservierung mit Trehalose für kürzere und längere Zeiträume die Fähigkeit von CD34 + -Zellen bei, sich nach dem Auftauen in megakaryopoetische Zellen zu differenzieren. Diese Ergebnisse deuten auf die Fähigkeit von Trehalose hin, die Lebensfähigkeit und Funktionen von Stammzellen beizubehalten, wenn sie als Kryoprotektor verwendet werden.
Die Langzeitlagerung von roten Blutkörperchen (Erythrozyten) und Blutplättchen unter Beibehaltung einer hohen Lebensfähigkeit hat wichtige Auswirkungen auf die Bluttransfusion und die klinische Medizin. Satpathy et al. beschrieben wurde ein Verfahren zum Beladen von Erythrozyten mit Trehalose aus einem extrazellulären Medium unter Verwendung eines osmotischen Ungleichgewichts und eines Phospholipidphasenübergangs, der zu intrazellulären Trehalosekonzentrationen von 40 mm führte . Es wurde festgestellt, dass Trehalose den osmotischen Schutz der Erythrozyten für längere Zeiträume ausübt. Die Gefriertrocknung der mit Trehalose beladenen Erythrozyten, gefolgt von einer Rehydratation, führte zu einem Überleben von 55% unter Beibehaltung ihrer Morphologie. Die überlebenden Zellen synthetisierten ATP und 2,3-Diphosphoglycerat (DPG) und hatten niedrige Methämoglobinspiegel. Die Aktivität von SOD und Katalase und die Sekundärstruktur von Hämoglobin in den gefriergetrockneten Erythrozyten waren alle denen von frischen Erythrozyten sehr ähnlich. Diese Studie zeigte, dass die Trehalose-Beladung zur Stabilisierung des Hämoglobins erforderlich war und einen wichtigen Schritt zur Kryokonservierung von Erythrozyten darstellte.
Die normale Lagerzeit menschlicher Blutplättchen in Blutbanken beträgt 5 Tage, danach werden sie verworfen, was zu einem chronischen Mangel an Blutplättchen führt, die für die Transfusion erforderlich sind. Als Versuch zur Kryokonservierung von Blutplättchen für längere Zeiträume, Wolkers et al. beschrieben ein Verfahren zur Einführung von Trehalose in das Zytoplasma menschlicher Blutplättchen . Es wurde festgestellt, dass Trehalose von den menschlichen Blutplättchen bei 37 ° C mit einer Beladungseffizienz von mehr als 50% leicht aufgenommen wird. Gefriertrocknung und Rehydratation der Trehalose-beladenen Thrombozyten führten zu einer ausgezeichneten Erholung intakter Thrombozyten mit einer Überlebensrate von 85%. Diese Blutplättchen reagierten fast identisch mit frischen Blutplättchen auf Agonisten wie Thrombin, ADP, Kollagen und Ristocetin. Die Membranmikrodomänen und Proteinkomponenten von Trehalose-beladenen Thrombozyten wurden nach Gefriertrocknung und Rehydratation intakt gehalten.
Die schützende Wirkung von Trehalose wurde auch in dessizierten Hornhautepithelzellen nachgewiesen. Die Präinkubation von kultivierten Hornhautepithelzellen mit Trehalose und anschließender Trocknung führte zu einer signifikanten Verringerung des Anteils toter Zellen im Vergleich zum Kontrollmedium . Die Schutzwirkung wurde auch ex vivo in enukleierten Schweineaugen bestätigt, wo das mit Trehalose inkubierte Gewebe sichtbar glatter war . Diese Ergebnisse zeigen den Nutzen von Trehalose in der Augenheilkunde und seine mögliche Anwendung als Augentropfen für trockenes Auge-Syndrom.
Die Verwendung von Trehalose zur Kryokonservierung von Organellen wurde von Yamaguchi et al., die Trehalose als Kryoprotektor für gefrorene Mitochondrien verwendeten . Mitochondrien, die in Gegenwart von Trehalose eingefroren wurden, zeigten die Integrität und Reaktionsfähigkeit der mitochondrialen Außenmembran (MOM) auf Proteine der Bcl-2-Familie, die denen frischer Mitochondrien ähnlich waren. Die Ultrastruktur, die ATP-Synthese, das Transmembranpotential, die calciuminduzierte Quellung sowie der Import und die Verarbeitung von Vorläuferproteinen wurden ebenfalls in Gegenwart von Trehalose erhalten. Dies unterscheidet sich von dem Standard-Saccharose-Mannitol-Puffer, der zum Einfrieren von Mitochondrien verwendet wird und häufig undicht wird. So konnte Trehalose die meisten biologischen Merkmale der Mitochondrien beibehalten, und Trehalose-gefrorene Mitochondrien können für die Erforschung der Apoptose und anderer mitochondrialer Funktionen verwendet werden, die auf ihrer Integrität beruhen.
Trehalose wurde zur Konservierung von Organen über längere Zeiträume verwendet. Eine „ET-Kyoto-Lösung“ wurde von der Wada-Gruppe zur Konservierung der Lunge von Hunden für > 30 Stunden entwickelt, ohne die Leistung von Endothelzellen und Gefäßen zu beeinträchtigen . Mit Trehalose wurde auch eine längere Stabilisierung und Konservierung von Impfstoffen und Antikörpern erreicht.
