Die N-terminale Sequenzierung, oft als Edman-Sequenzierung oder Edman-Abbau bezeichnet, ist eine wichtige Technik in der Proteinstudie und bleibt ein einzigartiger Ansatz, der neue Proteinsequenzdaten liefern kann. Es ist auch die bevorzugte Technik zur schnellen Bestätigung der Proteinexpression.
Die Chemie dieses Ansatzes wurde erstmals 1950 von P. Edman von der Universität Lund in Schweden eingeführt und während seiner Arbeit in Melbourne, Australien, zu dem vermutlich ersten automatisierten Peptidsequenzierungsgerät weiterentwickelt.
Edmans Chemie
Bild 1. Edman-Abbauchemie für die N-terminale Proteinsequenzierung.
Die chemischen Reaktionen, die die hydrolysierte N-terminale markierte Aminosäure ergeben, sind in Abb. 1 dargestellt. Jeder Zyklus umfasst im Wesentlichen 3 Schritte:
- Kupplung des Phenylisothiocyanats (PITC, Edman-Reagenz) an das Alpha-Amin der Polypeptidkette unter basischen Bedingungen unter Bildung einer Phenylthiocarbamyl (PTC)-Einheit.
- Spaltung unter milden sauren Bedingungen erzeugt einen freien Aminoterminus auf dem Polypeptid und eine Anilinothiazolinon (ATZ) -adduzierte Aminosäure.
- Letzteres wird extrahiert und weiter in ein stabileres Phenylthiohydantoin (PTH) -Derivat umgewandelt.
Der resultierende PTH-Rückstand wird mittels HPLC analysiert und Retentionszeiten mit denen von Standard-PTH-Aminosäuren verglichen.
Nebenreaktionen und Nebenprodukte
Die Sequenzierung der Zykluschemie und Aufarbeitung ist gut kontrolliert und liefert perfekt definierte Spezies.
Wie in Abbildung 2 gezeigt, stammen sie hauptsächlich aus der PITC-Hydrolyse und Methanolyse während des Zyklus und umfassen Diphenylthioharnstoff (DPTU), N-Phenyl, O-Methylthiocarbonat (PMTC) und Diphenylharnstoff (DPU), Nebenprodukte, die zusammen mit PTH-Aminosäuren extrahieren und eluieren.
