Methoden der Proteinreinigung: 4 Methoden

Dieser Artikel beleuchtet die vier Methoden der Proteinreinigung.

Die vier Methoden der Proteinreinigung sind: (1) Extraktion (2) Fällung und differentielle Solubilisierung (3) Ultrazentrifugation und (4)Chromatographische Methoden.

Die bei der Proteinreinigung verwendeten Methoden lassen sich grob in analytische und präparative Methoden unterteilen.

Die Unterscheidung ist nicht genau, aber der entscheidende Faktor ist die Menge an Protein, die mit dieser Methode praktisch gereinigt werden kann. Analytische Methoden zielen darauf ab, ein Protein in einer Mischung nachzuweisen und zu identifizieren, während präparative Methoden darauf abzielen, große Mengen des Proteins für andere Zwecke wie die Strukturbiologie oder den industriellen Einsatz herzustellen. Im Allgemeinen können die präparativen Methoden in analytischen Anwendungen verwendet werden, nicht jedoch umgekehrt.

Methode # 1. Extraktion:

Je nach Quelle muss das Protein durch Aufbrechen des Gewebes oder der Zellen, die es enthalten, in Lösung gebracht werden. Es gibt mehrere Methoden, um dies zu erreichen; Wiederholtes Einfrieren und Auftauen, Beschallung, Homogenisierung durch Hochdruck oder Permeabilisierung durch organische Lösungsmittel. Die Methode der Wahl hängt davon ab, wie zerbrechlich das Protein ist und wie robust die Zellen sind.

Nach diesem Extraktionsprozess befindet sich lösliches Protein im Lösungsmittel und kann von Zellmembranen, DNA usw. getrennt werden. durch Zentrifugation. Der Extraktionsprozess extrahiert auch Proteasen, die mit der Verdauung der Proteine in der Lösung beginnen. Wenn das Protein gegenüber Proteolyse empfindlich ist, ist es normalerweise wünschenswert, schnell vorzugehen und den Extrakt gekühlt zu halten, um die Proteolyse zu verlangsamen.

Methode # 2. Fällung und differentielle Solubilisierung:

Bei der Bulk-Proteinreinigung ist ein häufiger erster Schritt zur Isolierung von Proteinen die Fällung mit Ammoniumsulfat (NH4)2SO4. Dies geschieht durch Zugabe zunehmender Mengen an Ammoniumsulfat und Sammeln der verschiedenen Fraktionen des Präzipitatproteins. Ein Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass es kostengünstig mit sehr großen Volumina durchgeführt werden kann.

Die ersten zu reinigenden Proteine sind wasserlösliche Proteine. Die Reinigung von integralen Membranproteinen erfordert eine Unterbrechung der Zellmembran, um ein bestimmtes Protein von anderen zu isolieren, die sich im selben Membrankompartiment befinden. Manchmal kann ein bestimmtes Membranprotein zuerst isoliert werden, z. B. das Isolieren von Mitochondrien aus Zellen, bevor ein Protein gereinigt wird, das sich in einer Mitochondrienmembran befindet.

Ein Detergens wie Natriumdodecylsulfat (SDS) kann verwendet werden, um Zellmembranen aufzulösen und Membranproteine während der Reinigung in Lösung zu halten; da SDS jedoch eine Denaturierung verursacht, können mildere Detergenzien wie Triton X-100 oder CHAPS verwendet werden, um die native Konformation des Proteins während der Reinigung beizubehalten.

Methode # 3. Ultrazentrifugation:

Zentrifugation ist ein Prozess, der Zentrifugalkraft verwendet, um Mischungen von Partikeln unterschiedlicher Masse oder Dichte zu trennen, die in einer Flüssigkeit suspendiert sind. Wenn ein Gefäß (typischerweise ein Röhrchen oder eine Flasche), das eine Mischung aus Proteinen oder anderen Partikeln wie Bakterienzellen enthält, mit hohen Geschwindigkeiten gedreht wird, ergibt der Drehimpuls eine nach außen gerichtete Kraft für jedes Partikel, die proportional zu seiner Masse ist.

Die Tendenz eines bestimmten Partikels, sich aufgrund dieser Kraft durch die Flüssigkeit zu bewegen, wird durch den Widerstand ausgeglichen, den die Flüssigkeit auf das Partikel ausübt. Der Nettoeffekt des „Spinnens“ der Probe in einer Zentrifuge besteht darin, dass sich massive, kleine und dichte Partikel schneller nach außen bewegen als weniger massive Partikel oder Partikel mit mehr „Widerstand“ in der Flüssigkeit.

Wenn Suspensionen von Partikeln in einer Zentrifuge „gesponnen“ werden, kann sich am Boden des Gefäßes ein „Pellet“ bilden, das für die massivsten Partikel mit geringem Widerstand in der Flüssigkeit angereichert ist. Die verbleibenden, nicht verdichteten Partikel, die noch größtenteils in der Flüssigkeit verbleiben, werden als „Überstand“ bezeichnet und können aus dem Gefäß entfernt werden, um den Überstand vom Pellet zu trennen.

Die Zentrifugationsgeschwindigkeit wird durch die auf die Probe aufgebrachte Winkelbeschleunigung angegeben, die typischerweise im Vergleich zur g gemessen wird. Wenn die Proben lange genug zentrifugiert werden, erreichen die Partikel im Gefäß ein Gleichgewicht, wobei sich die Partikel spezifisch an einem Punkt im Gefäß ansammeln, an dem ihre Auftriebsdichte mit der Zentrifugalkraft ausgeglichen ist. Eine solche „Gleichgewichts“ -Zentrifugation kann eine umfassende Reinigung eines gegebenen Partikels ermöglichen.

Saccharose-Gradientenzentrifugation:

Ein linearer Konzentrationsgradient von Zucker (typischerweise Saccharoseglycerin oder Percoll) wird in einem Rohr so erzeugt, dass die höchste Konzentration unten und die niedrigste oben liegt. Eine Proteinprobe wird dann auf den Gradienten geschichtet und mit hohen Geschwindigkeiten in einer Ultrazentrifuge gesponnen. Dies bewirkt, dass schwere Makromoleküle schneller zum Boden des Rohrs wandern als leichteres Material.

Während der Zentrifugation in Abwesenheit von Saccharose erfahren die Partikel, wenn sie sich immer weiter vom Rotationszentrum entfernen, immer mehr Zentrifugalkraft (je weiter sie sich bewegen, desto schneller bewegen sie sich). Das Problem dabei ist, dass der nutzbare Trennbereich innerhalb des Gefäßes auf ein kleines beobachtbares Fenster beschränkt ist.

Eine doppelt so lange Probe zu drehen bedeutet nicht, dass das interessierende Teilchen doppelt so weit geht; Tatsächlich wird es deutlich weiter gehen. Wenn sich die Proteine jedoch durch einen Saccharose-Gradienten bewegen, treffen sie auf Flüssigkeit mit zunehmender Dichte und Viskosität.

Ein richtig konstruierter Saccharose-Gradient wirkt der zunehmenden Zentrifugalkraft entgegen, so dass sich die Partikel in engem Verhältnis zu der Zeit bewegen, in der sie sich im Zentrifugalfeld befanden. Proben, die durch diese Gradienten getrennt sind, werden als „ratenzonale“ Zentrifugationen bezeichnet. Nach Abtrennung des Proteins/der Partikel wird der Gradient dann fraktioniert und gesammelt.

Methode # 4. Chromatographische Verfahren:

Üblicherweise enthält ein Proteinreinigungsprotokoll einen oder mehrere chromatographische Schritte. Das grundlegende Verfahren in der Chromatographie besteht darin, die Lösung, die das Protein enthält, durch eine Säule zu fließen, die mit verschiedenen Materialien gefüllt ist. Verschiedene Proteine interagieren unterschiedlich mit dem Säulenmaterial und können somit durch die zum Passieren der Säule erforderliche Zeit oder die zum Eluieren des Proteins aus der Säule erforderlichen Bedingungen getrennt werden. Üblicherweise werden Proteine, die aus der Säule austreten, durch ihre Absorption bei 280 nm nachgewiesen.

Es gibt viele verschiedene chromatographische Methoden:

1. Größenausschlusschromatographie:

Chromatographie kann verwendet werden, um Protein in Lösung oder denaturierenden Bedingungen unter Verwendung von porösen Gelen zu trennen. Diese Technik wird als Größenausschlusschromatographie bezeichnet. Das Prinzip ist, dass kleinere Moleküle ein größeres Volumen in einer porösen Matrix durchqueren müssen. Folglich benötigen Proteine eines bestimmten Größenbereichs ein variables Volumen an Elutionsmittel (Lösungsmittel), bevor sie am anderen Ende der Gelsäule gesammelt werden.

Im Rahmen der Proteinreinigung wird das Elutionsmittel üblicherweise in verschiedenen Reagenzgläsern gebündelt. Alle Reagenzgläser, die keine messbare Spur des zu reinigenden Proteins enthalten, werden verworfen. Die verbleibende Lösung wird somit aus dem zu reinigenden Protein und allen anderen ähnlich großen Proteinen hergestellt.

2. Ionenaustauschchromatographie:

Die Ionenaustauschchromatographie trennt Verbindungen nach Art und Grad ihrer Ionenladung. Die zu verwendende Säule wird entsprechend ihrer Art und Stärke der Ladung ausgewählt. Anionenaustauscherharze haben eine positive Ladung und werden verwendet, um negativ geladene Kometen zurückzuhalten und abzutrennen, während Kationenaustauscherharze eine negative Ladung haben und zur Abtrennung positiv geladener Moleküle verwendet werden.

Bevor die Trennung beginnt, wird ein Puffer durch die Säule gepumpt, um die entgegengesetzten geladenen Ionen auszugleichen. Bei der Injektion der Probe tauschen sich gelöste Moleküle mit den Pufferionen aus, da jede um die Bindungsstellen auf dem Harz konkurriert. Die Länge der Retention für jeden gelösten Stoff hängt von der Stärke seiner Ladung ab.

Die am schwächsten geladenen Verbindungen eluieren zuerst, gefolgt von solchen mit sukzessiv stärkeren Ladungen. Aufgrund der Art des Trennmechanismus spielen pH-Wert, Puffertyp, Pufferkonzentration und Temperatur eine wichtige Rolle bei der Steuerung der Trennung. Ionenaustauschchromatographie ist ein sehr leistungsfähiges Werkzeug für Gebrauch in der Proteinreinigung und wird häufig in den analytischen und vorbereitenden Trennungen verwendet.

3. Affinitätschromatographie:

Die Affinitätschromatographie ist eine Trenntechnik, die auf molekularer Konformation basiert und häufig anwendungsspezifische Harze verwendet. Diese Harze weisen an ihren Oberflächen Liganden auf, die spezifisch für die zu trennenden Verbindungen sind. Am häufigsten funktionieren diese Liganden ähnlich wie Antikörper-Antigen-Interaktionen. Diese „Lock and Key“ -Anpassung zwischen dem Liganden und seiner Zielverbindung macht ihn hochspezifisch und erzeugt häufig einen einzelnen Peak, während alles andere in der Probe nicht zurückgehalten wird.

Viele Membranproteine sind Glykoproteine und können durch Lektinaffinitätschromatographie gereinigt werden. Detergenslösliche Proteine können an ein Chromatographieharz binden, das so modifiziert wurde, dass es ein kovalent gebundenes Lektin aufweist.

Proteine, die nicht an das Lektin binden, werden weggewaschen und dann können spezifisch gebundene Glykoproteine durch Zugabe einer hohen Konzentration eines Zuckers eluiert werden, der mit den gebundenen Glykoproteinen an der Lektin-Bindungsstelle konkurriert. Einige Lektine haben eine hohe Affinitätsbindung an Oligosaccharide von Glykoproteinen, die schwer mit Zuckern zu konkurrieren ist, und gebundene Glykoproteine müssen durch Denaturierung des Lektins freigesetzt werden.

4. Metallbindung:

Eine gängige Technik besteht darin, eine Sequenz von 6 bis 8 Histidinen in das C-Terminal des Proteins einzubauen. Das Polyhistidin bindet stark an zweiwertige Metallionen wie Nickel und Kobalt. Das Protein kann durch eine Säule geleitet werden, die immobilisierte Nickelionen enthält, die das Polyhistidin-Tag binden. Alle unmarkierten Proteine passieren die Säule.

Das Protein kann mit Imidazol eluiert werden, das mit dem Polyhistidin-Tag um die Bindung an die Säule konkurriert, oder durch eine Abnahme des pH-Werts (typischerweise auf 4,5), wodurch die Affinität des Tags für das Harz verringert wird. Während dieses Verfahren im Allgemeinen für die Reinigung von rekombinanten Proteinen mit einem konstruierten Affinitätstag (wie einem 6xHis-Tag oder Clontechs HAT-Tag) verwendet wird, kann es auch für natürliche Proteine mit einer inhärenten Affinität zu zweiwertigen Kationen verwendet werden.

5. Immunaffinitätschromatographie:

Die Immunaffinitätschromatographie nutzt die spezifische Bindung eines Antikörpers an das Zielprotein, um das Protein selektiv zu reinigen. Das Verfahren beinhaltet die Immobilisierung eines Antikörpers an ein Säulenmaterial, das dann selektiv das Protein bindet, während alles andere durchfließt. Das Protein kann durch Veränderung des pH-Wertes oder der Salinität eluiert werden. Da diese Methode kein Engineering in einem Tag beinhaltet, kann sie für Proteine aus natürlichen Quellen verwendet werden.

6. HPLC:

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie oder Hochdruckflüssigkeitschromatographie ist eine Form der Chromatographie, die Hochdruck anwendet, um die gelösten Stoffe schneller durch die Säule zu treiben. Dies bedeutet, dass die Diffusion begrenzt und die Auflösung verbessert wird. Die gebräuchlichste Form ist die „Reversed Phase“ HPLC, bei der das Säulenmaterial hydrophob ist.

Die Proteine werden durch einen Gradienten zunehmender Mengen eines organischen Lösungsmittels, wie Acetonitril, eluiert. Die Proteine eluieren entsprechend ihrer Hydrophobie. Nach der Reinigung durch HPLC liegt das Protein in einer Lösung vor, die nur flüchtige Verbindungen enthält und leicht lyophilisiert werden kann. Die HPLC-Reinigung führt häufig zu einer Denaturierung der gereinigten Proteine und ist daher nicht auf Proteine anwendbar, die sich nicht spontan wiederfalten.