ZUSAMMENFASSUNG
Influenzavirus-Neuraminidase (NA) spielt eine wesentliche Rolle bei der Freisetzung und Ausbreitung von Nachkommenvirionen nach dem intrazellulären Virusreplikationszyklus. Um zu testen, ob NA auch den Viruseintritt in die Zelle erleichtern könnte, infizierten wir Kulturen des menschlichen Atemwegsepithels mit humanen und aviären Influenzaviren in Gegenwart des NA-Inhibitors Oseltamivircarboxylat. Zwanzig- bis 500-fach weniger Zellen wurden in medikamentös behandelten versus nicht behandelten Kulturen infiziert (P < 0,0001) 7 h nach der Virusanwendung, was darauf hinweist, dass das Medikament die Initiierung der Infektion unterdrückte. Diese Daten zeigen, dass virale NA eine Rolle spielt früh in der Infektion, und sie bieten weitere Gründe für die prophylaktische Verwendung von NA-Inhibitoren.
Es wird angenommen, dass die Hauptfunktion der viralen Neuraminidase (NA) im Endstadium der Infektion liegt, wenn NA Sialinsäure von Zelloberflächen- und Nachkommenvirionen spaltet, was die Virusfreisetzung aus infizierten Zellen erleichtert (1, 2). Über NA-Funktionen während des Viruseintritts in die Zelle ist weniger bekannt. Es wurde lange angenommen, dass NA den Viruszugang zu Zielzellen in den Atemwegen durch Schleimabbau fördert (3). Dieses Konzept wurde jedoch aufgrund des Fehlens eines adäquaten experimentellen Systems nie formal bewiesen. Darüber hinaus wurde über einige Beweise berichtet, die gegen die Rolle von NA in den frühen Stadien der Infektion sprechen (siehe Referenz 2).
Um dieses Problem anzugehen, untersuchten wir die Auswirkungen des NA-Inhibitors Oseltamivircarboxylat (OC) (9) auf den Eintritt von Influenzavirus in Kulturen von menschlichem Atemwegsepithel. Primäre humane Tracheobronchialepithelzellen (HTBE; Clonetics) und primäre Nasenepithelzellen (PromoCell GmbH) wurden auf Membranträgern (12 mm Transwell-Clear; Corning, Inc.) an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche in serumfreiem Wachstumsfaktor- und Hormon-supplementiertem Medium (6, 8). Für alle Experimente wurden vollständig differenzierte, 4 bis 8 Wochen alte Kulturen verwendet. Diese Kulturen waren pseudostratifiziert und polarisiert; enthielt basale, bewimperte und schleimsekretierende Zellen; und ähnelte in vivo dem menschlichen Atemwegsepithel (Abb. 1). OC (1 µM, falls nicht anders angegeben) wurde Virussuspensionen und basolateralen Kompartimenten der Kulturen kurz vor der Infektion zweier Replikatkulturen von der apikalen Seite zugesetzt. Zwei Kontrollkulturen wurden in Abwesenheit eines Inhibitors infiziert. Eine Stunde nach der Infektion entfernten wir das Virusinokulum und inkubierten Kulturen an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche für zusätzliche 6 h, um die intrazelluläre Virusreplikation zu ermöglichen. Anschließend wurden die Kulturen fixiert und infizierte Zellen durch Anfärbung mit polyklonalen Antiseren zu ganzen Viren identifiziert, gefolgt von entsprechenden Peroxidase-markierten Sekundärantikörpern (Dianova) und Aminoethylcarbazolsubstrat (Sigma). Eine positive Färbung zeigte einen erfolgreichen Viruseintritt in die Zelle an. Die Kulturen wurden en face bei einer Vergrößerung von ×300 (Olympus IMT-2) analysiert. Eine Gesamtzahl von Zellen, die virales Antigen exprimieren, wurde im epithelialen Segment gezählt, das alle aufeinanderfolgenden mikroskopischen Ansichten (0,28 x 0,42 mm) entlang des Durchmessers der Kultur umfasste (Segmentoberfläche, 3 mm2; Anzahl der Zellen pro Segment, etwa 30.000). Vier Segmente pro Kultur wurden gezählt, indem die Kultur im Uhrzeigersinn um 45o gedreht wurde.
In zwei Experimenten mit HTBE-Kulturen infizierte das humane Virus A/B/14/96 (H1N1) in Gegenwart von NA-Inhibitor 22- und 65-fach weniger Zellen als Kontrollen (Abb. 2; Tabelle 1) (P < 0,0001). Die Viren A/Duck/Alberta/119/98 (H1N1) eines wilden Wasservogels und A/Pute/Alberta/2379/99 (H7N1) von Hausgeflügel waren in diesen Kulturen ebenfalls deutlich empfindlich gegenüber OK. In Nasenepithelkulturen reduzierte OC die Infektion mit humanen und Entenviren um das 120- bzw. 520-fache. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Hemmung der viralen NA die Einleitung einer Virusinfektion unterdrückt.
A/Chicken/Germany/R28/03 (H7N7) gehört zur hochpathogenen aviären Influenzavirus-Linie, die 2003 in kommerziellen Geflügelfarmen in den Niederlanden, Belgien und Deutschland zum Ausbruch der Geflügelpest führte. Diese Viren wurden auf mindestens 89 Menschen übertragen, von denen die meisten eine Bindehautentzündung aufwiesen, aber auch ein tödlicher Fall einer Lungenentzündung trat auf (5). Die H7N7-Hühnervirusinfektion in HTBE-Kulturen wurde in Gegenwart von 1 bzw. 0,1 µM OC um das 140- und 40-fache verringert. Diese Konzentrationen stellten typische maximale und minimale Plasmakonzentrationen des Arzneimittels dar, die beim Menschen nach Verabreichung von 75 mg Oseltamivirphosphat, der empfohlenen Dosis zur Prophylaxe, erreicht wurden (9).
Um die Hypothese zu bestätigen, dass die Infektionshemmung in unseren Experimenten direkt mit der Hemmung der viralen NA-Enzymaktivität zusammenhängt, verwendeten wir humanes A / …/5/97- wie Virus (H3N2) und seine Oseltamivir-resistente Mutante mit einer R292K-Substitution in der NA, die die NA 9.000-fach weniger empfindlich gegenüber einer Hemmung durch OC macht (4). In Übereinstimmung mit der Hypothese wurde das humane Elternvirus stark durch OC gehemmt, während nur ein marginales Maß an Hemmung der resistenten Mutante beobachtet wurde, wenn beide Viren im selben Experiment in HTBE-Kulturen getestet wurden (Tabelle 1). Bisher war kein adäquater Zellkulturtest zur Überwachung der Influenzavirus-Resistenz gegen NA-Inhibitoren verfügbar, da die Sialinsäurerezeptoren beim Menschen und in herkömmlichen Laborzelllinien nicht übereinstimmen (9, 11). Unsere Ergebnisse legen nahe, dass differenzierte Kulturen des menschlichen Atemwegsepithels ein geeignetes Zellkultursystem zum Nachweis von Influenzavirus-Resistenzen gegen NA-Inhibitoren sein können.
Schließlich wird mit dem arzneimittelempfindlichen A / Sydney/5/97- wie Virus, testeten wir Infektionshemmung durch OC zu verschiedenen Zeiten nach Virusimpfung hinzugefügt. Während bei der Medikamentenzugabe kurz vor der Infektion 47-fach weniger Zellen infiziert wurden, führte eine 1-stündige Verzögerung der OC-Zugabe nur zu einer 1,5-fachen Hemmung gegenüber der unbehandelten Kontrolle (Tabelle 1). Wenn das Arzneimittel 4 h nach der Virusimpfung zugegeben wurde, wurde keine statistisch signifikante Hemmung beobachtet. Diese Daten deuten darauf hin, dass OC die frühesten Stadien der Infektion vor der Virusreplikation beeinflusste.
Zusammenfassend haben wir hier zum ersten Mal direkte experimentelle Beweise für die wesentliche Rolle von NA im Stadium der Virusinvasion des Flimmerepithels der menschlichen Atemwege vorgelegt. Die NA-Funktion in diesem Stadium ist höchstwahrscheinlich die Entfernung von Lockrezeptoren auf Mucinen, Zilien und zellulärem Glykokalix, deren starke Bindung an jedes Virus den Zugang zu funktionellen Rezeptoren auf der Oberfläche behindern würde Membran von Zielzellen. Andere NA—Funktionen – zum Beispiel die Förderung der Hämagglutinin—vermittelten Fusion (7) – können jedoch nicht ausgeschlossen werden, und es sind weitere Studien erforderlich, um die genauen Mechanismen zu spezifizieren, durch die NA den Viruseintritt in Atemwegsepithelzellen fördert.
Da noch kein Impfstoff gegen die hochpathogenen Vogelgrippeviren H7N7 und H5N1 verfügbar ist, bleiben antivirale Medikamente die einzige Option zur Bekämpfung der Vogelgrippe (10). Im Vergleich zu anderen Anti-Influenza-Mitteln sind die NA-Inhibitoren gut verträglich und wirksam gegen alle Stämme von Influenza A- und B-Viren. Es gab wenig Hinweise auf das Auftreten von Virusresistenzen, und die Infektiosität mutierter Viren ist normalerweise beeinträchtigt (9, 11). Die Fähigkeit von NA-Inhibitoren, Infektionen vor dem Eintritt des Virus in Zellen zu unterdrücken, unterstreicht ihr hohes Potenzial für vorbeugende Maßnahmen. Insbesondere liefern unsere Daten die wissenschaftliche Grundlage, um die prophylaktische Anwendung dieser Verbindungen bei Personen mit hohem Infektionsrisiko mit aviären Influenzaviren zu unterstützen.
