Kurze Einführung: Blotting-Techniken
Blotting wird in der Molekularbiologie zur Identifizierung von Proteinen und Nukleinsäuren eingesetzt und ist für diagnostische Zwecke weit verbreitet. Diese Technik immobilisiert das interessierende Molekül auf einem Träger, der eine Nitrozellulosemembran oder Nylon ist. Es verwendet Hybridisierungstechniken zur Identifizierung der spezifischen Nukleinsäuren und Gene.
Die Blotting-Technik ist ein Werkzeug zur Identifizierung von Biomolekülen wie DNA, mRNA und Protein in verschiedenen Stadien der Genexpression. Die Proteinsynthese beinhaltet die Expression eines DNA-Segments, das zur Herstellung des jeweiligen Proteins in mRNA umgewandelt wird.
Subtypen des Blottings wie Northern, Western & southern hängen von dem Zielmolekül ab, das gesucht wird. Wenn eine DNA-Sequenz die Grundlage oder der Code für ein Proteinmolekül ist, kann das jeweilige DNA-Molekül von Interesse mit der Southern-Blotting-Technik geblottet werden. Während der Genexpression, wenn die DNA als mRNA für eine Proteinproduktion exprimiert wird, kann dieser Prozess durch Northern Blotting identifiziert werden. Schließlich produziert die kodierte mRNA das betreffende Protein, diese Proteinidentifikation kann durch Western Blotting erfolgen.
Allgemeines Verfahren zum Blotten
- Homogenisieren Sie die Probe.
- Trennung des interessierenden Moleküls durch eine Elektrophoresemembran.
- Übertragung der Moleküle auf eine Nitrocellulose-Membran/Nylonmembran.
- Hybridisierung oder Identifizierung des Moleküls
Northern Blotting
Northern Blotting ist eine Technik zur Untersuchung der Genexpression. Dies geschieht durch Nachweis bestimmter RNA (oder isolierter mRNA). mRNA wird im Allgemeinen als 5% der gesamten RNA-Sequenz dargestellt. Diese Methode zeigt die Identität, Anzahl, Aktivität und Größe des jeweiligen Gens. Diese Blotting-Technik kann auch für das Wachstum eines Gewebes oder Organismus verwendet werden. In verschiedenen Stadien der Differenzierung und Morphogenese ändert sich die Häufigkeit einer RNA, und dies kann mit dieser Technik identifiziert werden. Es hilft auch bei der Identifizierung abnormaler, kranker oder infizierter Zustände auf molekularer Ebene. Die Northern Blot-Technik wurde 1977 von James Alwine, David Kemp und George Stank an der Stanford University entwickelt. Die Technik erhielt ihren Namen aufgrund der Ähnlichkeit des Prozesses mit Southern Blotting. Der Hauptunterschied zwischen diesen beiden Techniken besteht darin, dass das Northern Blotting nur RNA betrifft.
Prinzip
Wie alle normalen Blotting-Techniken beginnt das Northern Blotting mit der Elektrophorese, um RNA-Proben nach Größe zu trennen. Die Elektrophorese trennt die RNA-Moleküle basierend auf der Ladung der Nukleinsäuren. Die Ladung in den Nukleinsäuren ist proportional zur Größe der Nukleinsäuresequenz. Somit trennt die Elektrophoresemembran die Nukleinsäuresequenz entsprechend der Größe der RNA-Sequenz. In Fällen, in denen unsere Zielsequenz eine mRNA ist, kann die Probe durch Oligo-Cellulose-chromatographische Techniken isoliert werden, da mRNA durch den Poly (A) -Schwanz gekennzeichnet sind. Da Gelmoleküle von Natur aus zerbrechlich sind, werden die getrennten Sequenzen auf die Nylonmembranen übertragen. Die Auswahl der Nylonmembran trägt dazu bei, dass Nukleinsäuren in der Natur negativ geladen sind. Sobald die RNA-Moleküle übertragen sind, wird sie durch kovalente Verknüpfung immobilisiert. Die Sonde wird dann hinzugefügt, die Sonde kann komplementär zu einer ss-DNA-Sequenz sein. Formamid wird im Allgemeinen als Blotting-Puffer verwendet, da es die Glühtemperatur senkt.
Vorgehensweise
- Die entnommene Gewebe- oder Kulturprobe wird zunächst homogenisiert. Die Proben können repräsentativ für verschiedene Arten von Kultur zum Vergleich sein, oder es kann für die Untersuchung der verschiedenen Stadien des Wachstums innerhalb der Kultur sein.
- Die RNA-Sequenz wird in der Elektrophoreseeinheit abgetrennt ein Agarosegel wird zum Zwecke der Nukleinsäuretrennung verwendet.
- Nun wird die abgetrennte RNA-Sequenz auf die Nylonmembran übertragen. Dies geschieht durch zwei Mechanismen Kapillarwirkung und die ionische Wechselwirkung.
- Der Transfervorgang wird durchgeführt, indem das Gel in der folgenden Reihenfolge gehalten wird. Zuerst wird das Agarosegel auf den Boden des Stapels gelegt, gefolgt von der Blottingmembran. Auf diese Papiertücher wird ein mildes Gewicht (Glasplatte) gelegt. Das gesamte Setup wird in einem Becherglas mit Transferpuffer aufbewahrt.
- Auf die Nylonmembran übertragene RNA wird dann mittels UV-Strahlung fixiert.
- Die fixierte Nylonmembran wird dann mit Sonden vermischt. Die Sonden sind speziell für das interessierende Gen ausgelegt, so dass sie mit RNA-Sequenzen auf dem Blot hybridisieren, die der interessierenden Sequenz entsprechen.
- Die Blot-Membran wird gewaschen, um unerwünschte Sonde zu entfernen
- Markierte Sonde wird durch Chemilumineszenz oder Autoradiographie nachgewiesen. Das Ergebnis sind dunkle Bänder im Röntgenfilm.
GEl und Sonden
Die Trennung der RNA-Proben erfolgt unter Verwendung von Agarosegelen unter Verwendung von Formaldehyd als Denaturierungsmittel, aber in kleinen RNA- oder Mikro-RNA-Sequenzen können auch Polyacrylamid-Sequenzen mit Harnstoff als Denaturierungsmittel verwendet werden. Ethidiumbromid kann als Färbemittel verwendet werden. Zwei Arten von Markern dienen zur Größenmarkierung. Zur Identifizierung der Größe der RNA-Sequenzen werden eine RNA-Leiter und eine ribosomale Untereinheit verwendet.
Sonden können komplementär zur gesamten oder einem Teil der interessierenden RNA sein. Sie können RNA, DNA oder Oligonukleotide von 25 komplementären Basepaaren zur Ziel-RNA sein. Im Falle von RNA-Sonden werden von invitro hergestellte Sonden verwendet, da Invivo-Sonden aufgrund des rigorosen Waschens denaturieren können. Bei cDNA werden die Sonden mit radioaktiven Isotopen, alkalischer Phosphatase oder Meerrettichperoxidase bei Chemilumineszenz markiert.
