Onkologieberichte

Einführung

Obwohl kürzlich neuartige Therapien zur Behandlung von fortgeschrittenem Prostatakrebs in die klinische Praxis eingeführt wurden, ist Prostatakrebs 2014 die zweittödlichste Krebsart bei Männern in den USA geblieben (1). Neue therapeutische Ziele und Strategien sind dringend erforderlich, um das klinische Ergebnis von Patienten mit Prostatakrebs weiter zu verbessern.

Ein vielversprechendes therapeutisches Ziel ist die Cyclin-abhängige Kinase 5 (CDK5). CDK5 ist eine Serin / Threonin-Kinase, die anderen CDKs strukturell ähnlich ist (2). CDK5 scheint keine wesentliche Rolle bei der Zellzyklusregulation zu spielen (3,4). Es wurde für seine dominante Rolle bei der Entwicklung des Zentralnervensystems, einschließlich der Rolle inneuronaler Migration, Differenzierung und Adhäsion, gut charakterisiert (5,6). Weand andere zeigten anschließend, dass CDK5 spielt eine wichtige Rolle Inkrebsentwicklung und Metastasierung (7-12). In Prostate-Krebszellen zeigten wir, dass CDK5 für die Integrität des Zytoskeletts, die Zellmigration und -invasion und Invivo für die Metastasierung von entscheidender Bedeutung war (7). Inpankreatischem Krebs ist CDK5 intrinsisch für die KRAS-Signalisierung durch den zentral wichtigen RAL-Signaltransduktionsweg und stellt somit ein potenzielles ‚arzneimittelfähiges‘ Ziel für mutierte KRAS-Tumoren dar (8). Zusammengenommen weisen diese Studien darauf hin, dassdie Hemmung von CDK5 allein oder in Kombination mit anderen Wirkstoffen eine wirksame therapeutische Strategie für diese und Anderekrebstypen bieten kann.

In der vorliegenden Studie wollten wir Wirkstoffe identifizieren, die in Kombination mit einer CDK5-Hemmung bei Prostatakrebszellen besonders wirksam wären. Daher führten wir ascreen der Johns Hopkins Drug Library (JHDL) durch. Die JHDL ist eine Sammlung von 3.360 pharmazeutischen Verbindungen, die Sicherheitstests am Menschen für eine Vielzahl von Anwendungen erfolgreich abgeschlossen haben (13,14). Diese Bibliothek wurde erfolgreich zur Wiederverwendung von Verbindungen für die Krebstherapie verwendet, einschließlich der Identifizierung von Digoxin als HIF1a-Inhibitor (15) und Itraconazol als Angiogenese-Inhibitor (16). Wir haben die JHDL früher eingesetzt, um Cetrimoniumbromid und Irinotecan als Verbindungen mit erhöhter Antitumoraktivität gegen Prostatakrebszellen zu identifizieren, die niedrige Spiegel des Metastasensuppressorgens N-mycdownreguliertes Gen 1 (NDRG1) exprimieren (17).Hier führten wir ein ähnliches JHDL-Screening mit Prostatakrebszellen durch, die sich in der CDK5-Aktivität unterscheiden. Tiloron wurde als Verbindung mit in vitro synthetischer Letalität inCDK5-defizienten Prostatakrebszellen identifiziert.

Materialien und Methoden

Zellkultur

PC3-Prostatakrebszelllinien wurden vonatcc erhalten. Diese Zellen stammen aus einer Knochenmetastase eines 62-jährigen Prostatakrebspatienten. Menschliche Prostatafibroblasten, die von Dr. J. Isaacs bereitgestellt wurden, wurden aus einer Prostatabiopsie an einem 62-jährigen Prostatakrebspatienten mit einem Gleason-Score von 4 erhalten. Beide Zelllinien wurden in RPMI-1640 (Invitrogen) -Medien gezüchtet und gepflegt, die mit 10% fötalem Rinderserum ergänzt wurden. Die Zellen wurden in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C in einer 5% CO2-Atmosphäre kultiviert.

Schaffung der PC3 CDK5dn-Zelllinie

Der Verlust der CDK5-Funktion wurde in PC3-Zellen durch Transfektion eines dominant-negativen Konstrukts mit einer D144Nmutation erreicht, freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. L.H. Tsai (Harvard Medical School) (18). Das verwendete Protokoll wurde bereits beschrieben (7). Kurz gesagt, das Konstrukt wurde in einen bidirektionalen Tet-Vektor, pBI-EGFP (BD Biosciences), subkloniert, dem ein Zeocin-Resistenzgen zur Auswahl hinzugefügt wurde (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. K. Schuebel, Johns Hopkins University School of Medicine). Der PBI-EGFP-Leervektor oder der pBI-EGFPCDK5dn-Vektor wurde in PC3-Zellen transfiziert, die ein aTet-Off-Promotorkonstrukt, pTTa (BD Biosciences), enthielten.

Western Blotting

Western Blotting wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (19). Zehn Mikrogramm Protein wurden auf das Gel geladen. Primäre Antikörper wurden in gelöstblockierpuffer . Eine 1:1.000 Verdünnung wurde für Anti-CDK5 (Sigma-Aldrich) verwendet; Anti-Vinculin (Millipore, Upstate) wurde 1:4.000 verdünnt. Sekundärantikörper wurden bei einer Verdünnung von 1:4.000 verdünnt. Die Normalisierung der Bandenintensität wurde mit dem Haushälterprotein Vinculin durchgeführt. Entwickelte Blots wurdenmit einem Microtek-Scanner gescannt.

Wundheilungsassay

Wundheilungsassays wurden mit confluentPC3-Kontrolle (enthaltend den leeren pBI-EGFP-Vektor) oder PC3 CDK5DNZELLEN durchgeführt. Ein Gummischaber wurde verwendet, um einen Bereich von Zellen abzukratzen. Lichtmikroskopische Bilder wurden sofort und 24 hafter Schaben erfasst.

Small-molecule library Screening

Die JHDL-Bibliothek wurde zuvor beschrieben (13,14,17).Lagerung und Screening von JHDL-Verbindungen wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt (17).Kurz gesagt, PC3-Kontroll- und CDK5dn-Zellen wurden in 96-Well-Platten (1 × 103 Zellen / Well) ausgesät und über Nacht haften gelassen. Dann wurden 5 µl Arzneimittel, gelagert als Stammlösungen von 200 µM inDMSO/H2O, zu vollständigen RPMI-Medien gegeben, so dass Zellen mit einer Endkonzentration von 10 µM behandelt wurden. Nach 48 h Behandlung wurden 20 µl MTS-Reagenz aus dem CellTiter 96™ AqueousNon-Radioactive Cell Proliferation Assay für eine Dauer von 2-4 h bei 37 °C in jede Wanne gegeben. Die Platten wurden mit dem aSoftMax Pro-Plattenleser (Molecular Devices) analysiert. Die Proliferation von behandelten Zellen wurde mit der Proliferation von DMSO-behandelten PC3DN- oder CDK5dn-Zellen verglichen (Proliferationsindex). Proliferationsindices von PC3 CDK5dn Zellen wurden mit den Proliferationsindices von PC3 Kontrollzellen verglichen. Eine PubMed-Studie wurde durchgeführt, um die klinische Verwendung potenzieller Treffer zu bewerten.

MTS-Assays

MTS-Assays wurden durchgeführt, um die antiproliferative Wirkung der Tiloron-Behandlung zu messen. Tilorondihydrochlorid (Sigma-Aldrich) wurde als 10 mM Vorratslösung in DMSO bei -20°C gelagert. Eintausend PC3-Zellen wurden in 96-Well-Platten mit 100 µl kompletten RPMI-Medien plattiert. Bei etwa 50%iger Konfluenz wurde Tilorondihydrochlorid verabreicht. Für Experimente wurde die Verbindung in vollständigen RPMI-Medien verdünnt, um die gewünschte Endkonzentration zu erhalten. Nach 72-stündiger Behandlung (Tiloron-Monotherapie) wurde MTS-Reagenz zugegeben und die Absorption bei 490 nm mit einem SoftMax Pro-Plattenleser bestimmt.Proliferationsindizes wurden berechnet; unbehandelte PC3-Kontroll- oder CDK5DN-Zellen (in 103 µl kompletten RPMI-Medien) wurden als Kontrolle verwendet. Die T-Tests der Schüler wurden durchgeführt, um die p-Werte zu bewerten.

Klonogene Assays

Klonogene Assays wurden durchgeführt, um das Langzeitüberleben nach der Tiloron-Behandlung zu beurteilen. Prostatakrebszellen wereplated in 60 mm Schalen und erlaubt zu haften. Bei 50-60% Konfluenz wurden die Zellen 72 h lang mit Tiloron behandelt. Anschließend wurden 1 × 103 Zellen aus jeder Schale in 60-mm-Schalen dreifach plattiert und 12 Tage lang in vollständigen RPMI-Medien inkubiert.Kolonien wurden fixiert und mit einer Lösung angefärbt, die 90% Methanol und 10% Kristallviolettlösung (2,3% Kristallviolett, 0,1% Ammoniumoxalat und 20% Ethylalkohol; Sigma) enthielt. Kolonien werescanned mit einem Computerscanner (Microtek) und manuell gezählt.Die T-Tests des Studenten wurden durchgeführt, um zu bewerten, ob Unterschiede zwischen Zelllinien statistisch signifikant waren.

3D-Wachstums-Assay

3D-Wachstums-Assays wurden unter Verwendung des gleichen Protokolls wie zuvor beschrieben durchgeführt (17). Kurz gesagt, Sphäroide wurden erzeugt, indem PC3-Zellen 16 h lang als hängender Tropfen über einer befeuchteten Platte in einem CO2-Inkubator in vollständigem RPMI-Medium mit 0,5% Methylcellulose kultiviert wurden. Sphäroide wurden in eine Kollagenmatrix (BD Biosciences) eingebettet, mit Tiloron behandelt und am Tag der Behandlung und sechs Tage nach Behandlungsbeginn mit einem Nikon Eclipse Ti-Mikroskop (Nikon) abgebildet. Sphäroid- und Gesamtflächen (Spheroidplus Sprossen) wurden mit ImageJ gemessen. Die Faltenzunahmen wurden berechnet, indem das Sphäroid / die Gesamtfläche am Tag 6 durch das Sphäroid / die Gesamtfläche am Tag 0 für jedes einzelne Sphäroid dividiert wurde. Für jede Zelllinie und jeden Zeitpunkt wurden Faltenzunahmen von vier Sphäroiden gemittelt. Statistische Analysen wurden mit Student’st-Tests durchgeführt.

Ergebnisse

Unterdrückung der CDK5-Aktivität

PC3-Prostatakrebszellen wurden aufgrund ihres hohen Metastasierungspotentials und ihrer Androgenunabhängigkeit für den JHDLcompound-Bildschirm ausgewählt und ähneln damit aggressivem metastasiertem kastratresistentem Prostatakrebs. CDK5-Aktivität wurde gehemmt durchtransfektion und Selektion einer dominant-negativen Mutation (CDK5144N). Diese PC3-CDK5dn-Zellen wiesen im Vergleich zu den PC3-Kontrollzellen (PC3-Zellen, die mit einem leeren Vektor transfiziert wurden) einen höheren Proteinspiegel von totalCDK5 auf (Abb. 1A). Ein Wundheilungstest (8) bestätigte, dass CDK5 in diesen Zellen funktionell inaktiv war; Im Gegensatz zu den PC3control-Zellen hatten PC3 CDK5dn-Zellen nicht die Fähigkeit, in die abgekratzte Oberfläche einzudringen (Abb.1B).

Bibliotheksbildschirm für Verbindungen, die auf PC3-Zellen basierend auf CDK5-Aktivität abzielen

Es wurde ein Hochdurchsatz-Screening-Assay durchgeführt, um Verbindungen auszuwählen, die auf PC3-Zellen basierend auf CDK5-Aktivität abzielen. PC3DN- und CDK5dn-Zellen wurden 48 h bei 10 µM mit allen Verbindungen der Formel HDL behandelt. Um Treffer zu identifizieren, die selektiv AUFPC3-Zellen basierend auf CDK5-Expression abzielen, wählten wir alle Verbindungen aus, bei denen das Proliferationsindexverhältnis (CDK5dn / Kontrolle) unter 0,5 oder über 1,5 lag (Abb. 2A).Darüber hinaus musste hits die Zellproliferation von PC3-Zellen um mindestens 10% hemmen, da wir speziell an Verbindungen interessiert waren, die das Zellwachstum hemmten (horizontale und vertikale Linie in der Grafik). Wir wählten auch alle Verbindungen aus, die die Zellproliferation inPC3-Zellen um 70% hemmten (untere linke Ecke des Diagramms), da wir daran interessiert waren, potenzielle hochwirksame Antitumormittel zu identifizieren. Insgesamt wurden 41 Treffer zur weiteren Auswertung ausgewählt.

Es wurde ein Sekundärsieb durchgeführt, bei dem ausgewählte Treffer aus dem Primärsieb bei 10 µM für 48 h zu PC3control- und CDK5dn-Zellen in dreifacher Ausfertigung hinzugefügt wurden, um falsch positive Ergebnisse auszusortieren (Abb. 2B). Grenzwerte waren etwas weniger streng als im Primärbildschirm; Verbindungen wurden als Treffer angesehen, wenn das Verhältnis der Proliferationsindizes (CDK5dn / Kontrolle) unter 0,7 oder über 1,4 lag. Dies führte zur Identifizierung von drei Verbindungen, die selektiv auf CDK5-exprimierende PC3-Zellen abzielen: rutilantin, Ethacridinlactat Undcetalkoniumchlorid (Abb. 2C).Diese Verbindungen wurden nicht als Antitumormittel verwendet, und ihre potenzielle klinische Verwendung als intravenöse Antitumormittel scheint begrenzt zu sein (20-23). Eine andere Verbindung, Tiloronanalogr9536-DA, war hochwirksam bei der Hemmung beider isogener PC3-Zelllinien (> 70% Hemmung), hemmte jedoch die Proliferation von PC3CDK5dn-Zellen etwas wirksamer (Verhältnis CDK5dn / Kontrolle: 0,687). Tiloron und seine Analoga haben antivirale Aktivität, wirken zumindest teilweise als Interferoninduktoren (24-26) und es wurde präklinisch und klinisch gezeigt, dass sie auch eine Antitumoraktivität aufweisen (27,28).

Tiloron zielt selektiv auf PC3-Zellen mit geringer CDK5-Aktivität ab

Wir setzten unsere Experimente mit frisch Gelöstemtilorondihydrochlorid fort. Nach 72 h Tiloronbehandlung in verschiedenen Konzentrationen wurde sein IC50 bei 8–12µM in PC3-CDK5dn-Zellen und 15 µM in PC3-Kontrollzellen in MTS-Assays (Abb. 3A). Bei 8 µM war die Proliferationsaktivität in der PC3-Kontroll- bzw. CDK5DN-Zelle um 24 % bzw. 47% erniedrigt (p=0,001). Zur Beurteilung der Toxizität von Tiloron innormale Prostatazellen, MTS-Assays wurden mit Tiloronbehandlung von menschlichen Prostatafibroblasten durchgeführt (Abb. 3B). Die Empfindlichkeit dieser Zellen gegenüber Tiloron war ähnlich der der PC3-Kontrollzellen.

Die inhibitorische Wirkung von Tiloron in PC3-Zellen wurde weiter durch klonogene Assays untersucht (Abb. 3C). PC3 CDK5dn Zellen waren alsosignificantly empfindlicher als PC3 Kontrollzellen zu tilorone inthis Probe. Die Behandlung mit 10 µM Tiloron führte zu einem Klonogenüberleben von 40% in PC3-CDK5dn-Zellen und 72% in PC3-Kontrollzellen (p= 0,002).

Ein Sphäroidwachstumstest wurde durchgeführt, um das 3DTUMORWACHSTUM und die Invasion von PC3-Zellen nach Tiloronbehandlung zu bewerten (Abb. 4). Sowohl PC3-Kontroll- als auch PC3CDK5dn-Zellen wiesen über sechs Tage eine vergleichbare Zunahme der Sphäroidgröße auf. Die Gesamtgröße (die Größe der Sphäroide plus Sprossen) hatte jedoch einen höheren Anstieg der PC3-Kontrollzellen, was bestätigte, dass unbehandelte PC3-CDK5dn-Zellen im Vergleich zu PC3-Kontrollzellen ein verringertes invasives Potenzial aufwiesen. Wenn tilorone bei 5µM verabreicht wurde, hatten PC3-Kontrollkügelchen ein ähnliches Wachstum und invasives Muster wie die unbehandelten PC3-Kontrollzellen (p = 0,59) (Abb. 4B, linkes Diagramm). Wenn jedoch Chloron in der gleichen Konzentration an PC3-CDK5DN-Zellen verabreicht wurde, wurde eine signifikante Abnahme sowohl der Sphäroidgröße als auch der Gesamtgröße beobachtet (p < 0,01), was darauf hindeutet, dass Tiloron das Sphäroidwachstum und die Invasion von PC3-CDK5dn-Zellen erfolgreich hemmt, wenn es bei 5 µM verabreicht wird (Abb. 4B, rechte Grafik). Bei 10 µM hatten beide isogenen Zelllinien ein vermindertes invasives Potential.

Die JHDL, eine Bibliothek gut charakterisierter pharmazeutischer Verbindungen, wurde entwickelt, um Studien zur Wiederverwendung von Arzneimitteln zu erleichtern (29). Die umfangreichen In-vivo-Toxizitäts- und pharmakokinetischen Profile der Verbindungen in der Bibliothek ermöglichen eine schnelle nachfolgende Entwicklung dieser Verbindungen. Einige Mittel vom JHDL sind advancedto zu den klinischen Studien für Krebs und andere therapeutische Anwendungen gewesen (13,14,16,17,30–32).

In der vorliegenden Studie untersuchten wir die JHDL auf Verbindungen, die das Krebszellwachstum bei Vorhandensein einer CDK5-Hemmung differentiell hemmen; tiloron und ein Tiloron-Analogon wurden als Mittel identifiziert, die selektiv auf CDK5-defiziente Pc3prostatakrebszellen abzielen. Tiloron (Amixin IC) wird in einigen Ländern klinisch als oral wirksames antivirales Mittel eingesetzt (25). Tiloron wurde am Menschen zur Behandlung von zerebralen Gliomen, Larynxpapillomatose und Brustkrebs getestet (28,33,34).Obwohl über eine Antitumorwirksamkeit berichtet wurde, ist das Interesse an Tiloron für die Krebstherapie abgeklungen. Kürzlich berichteten Zhou et al.neue Tiloron-Analoga mit verbesserter Antikrebsaktivität (35). Diese Analoga können vielversprechend seinexamin, insbesondere in Kombination mit CDK5-Hemmung.

Zusätzlich zu der Möglichkeit, dass Tiloron in Kombination mit einer CDK5-Hemmung vielversprechend sein kann, legt die Identifizierung von Tiloron als Wirkstoff, der selektiv auf Zellen mit aktivem CDK5 abzielt, mögliche Wirkstoffklassen nahe, um die Wirksamkeit der CDK5-Hemmung zu potenzieren. Tiloron wurde als Aninterferon-Induktor charakterisiert (24). Dies deutet darauf hin, dass Interferon selbst oder ein alternativer Interferoninducer wie ein TLR-Agonist in Kombination mit einem aCDK5-Inhibitor nützlich sein kann. Dennoch können andere Mechanismen beteiligt sein. Zum Beispiel ist Tiloron auch ein DNA-Interkalierungsmittel (24), und man kann sich vorstellen, dass es die Chromatinstruktur und die Genexpression modulieren kann. Andere Funktionen von Tiloron, einschließlich Signalweg- und Transkriptionsfaktorinteraktionen (36,37), können ebenfalls beteiligt sein. Weitere studiesare benötigt, um den genauen Mechanismus der Aktion zu entwirren, durch die tilorone selektiv CDK5-negative prostatakrebszellen anvisiert.

Danksagung

Die Autoren danken den Professoren P.J. Van Diestand E. Van der Wall für ihre Unterstützung und Diskussion und ProfessorsM.A. Carducci und J.T. Isaacs für ihre Bereitstellung von Labormaterialien. Diese Studie wurde vom Flight Attendant MedicalResearch Institute, NCI R01 CA085567, R01 CA134767, DOD grantW81XWH, unterstützt-06-1-0139 und NCI SPORT gewähren P50 CA58236. M.D.W. wurde vom Dr. Saal van Zwanenbergstichting and HuygensScholarship Programm unterstützt.