PMC

1detaillierte Protokolle und Tipps zur Fehlerbehebung für alle Aspekte des GST-Genfusionsprotein-Expressionssystems sind von GE Healthcare in den Handbüchern erhältlich: GST-Genfusionssystem, Artikelnummer 18-1157-58 und das Handbuch für rekombinante Proteine, Artikelnummer 18-1142-75. Die Handbücher sind in gedruckter Form erhältlich oder können als PDF auf der GE Healthcare-Website abgerufen werden.

2Die Verwendung von JM105 oder einem ähnlichen Stamm wird zur Klonierung und Aufrechterhaltung des Vektors empfohlen. Stämme von BL21 und seinen Derivaten oder ein anderer Protease-defizienter Stamm werden für eine maximale Proteinexpression empfohlen. Stämme mit einem Mangel an cytoplasmatischen Protease-Genprodukten wie Lon, ompT, degP oder htpR können die Auswirkungen des proteolytischen Abbaus von überexprimiertem Protein durch den Wirt minimieren. Verwenden Sie keinen Stamm von E. coli, der das rec1A-Allel trägt, um pGEX-Plasmide zu vermehren, da Deletionen oder Umlagerungen von Plasmid-DNA berichtet wurden.

3glutathion Sepharose 4B Bulk Media wird in diesem Reinigungsprotokoll verwendet. Dieses Chromatographiemedium ist ideal für Screening-Bedingungen und ermöglicht eine einfache Skalierung. Reinigungen werden leicht unter Verwendung entweder des Schwerkraftflusses oder eines Niederdruckchromatographiesystems durchgeführt oder können in den Reihenreinigungen verwendet werden, die auf Zentrifugation basieren. G-FF-Affinitätssäulen sind 1 ml- oder 5 ml-Fertigsäulen, die ebenfalls erhältlich sind und zum Scale-up in Reihe geschaltet werden können. Diese Spalten sind für Gebrauch mit einem flüssigen chromatographischen System, einer Pumpe oder einer Spritze. Zusätzlich zu diesen Formaten ist Glutathionsepharose auch in Spinsäulen und 96-Well-Plattenformaten für ein schnelles Screening der Expression und Reinigung von GST-Fusionsproteinen erhältlich.

4DFP ist ein extrem gefährliches Neurotoxin. Befolgen Sie die vom Hersteller angegebenen Vorsichtsmaßnahmen und behandeln Sie das saubere Reagenz nur in einem chemischen Abzug.

5Die Zugabe von Proteaseinhibitoren zum Lysepuffer trägt dazu bei, den proteolytischen Abbau des Zielproteins während der Extraktion zu verhindern. Der genaue Cocktail der dem Lysepuffer zugesetzten Proteaseinhibitoren sollte jedoch auf die Eigenschaften des Zielproteins zugeschnitten sein. Reduktionsmittel wie 2-ME, DTT oder TCEP in Konzentrationen von 1-10 mm sollten dem Puffer nach Bedarf zugesetzt werden. Zusatz eines nichtionischen Reinigungsmittels, wie 1% Triton X-100, kann dem Puffer auch hinzugefügt werden, um in der Extraktion zu helfen.

6folgend ist ein Screening-Protokoll zur Überprüfung der Proteinexpression von Fusionsprotein in Minikulturen. Das Vorhandensein eines Anstiegs der Proteinspiegel beim erwarteten Molekulargewicht auf einem SDS-PAGE-Gel nach Induktion mit IPTG ist ein guter Hinweis auf eine erfolgreiche Proteinexpression. Nach der Induktion sollte eine markante Bande beim erwarteten Molekulargewicht (Molekulargewicht des Zielproteins + ~ 26 KDa für die GST-Einheit) sichtbar sein. Wenn vermutet wird, dass das Protein auf einem niedrigen Niveau exprimiert wird, kann die Überprüfung der korrekten Expression durch Western-Blotting mit einem Antikörper durchgeführt werden, der entweder für das Zielprotein oder für GST spezifisch ist. Wenn die Proben nicht sofort von SDS-PAGE analysiert werden, können sie über Nacht bei 4 ° C oder bei -20 ° C für eine längerfristige Lagerung gelagert werden.

1. Inokulieren Sie mehrere isolierte Kolonien in separate 50-ml-Zentrifugenröhrchen mit 10 ml LB, ergänzt mit 100 µg / ml Ampicillin. Wachsen Sie eine Nachtkultur bei 37 ° C unter Schütteln.

2. Am nächsten Morgen werden 0,5 ml Kultur über Nacht zu 4,5 ml LB mit 100 µg / ml Ampicillin gegeben. Wachsen 1 h bei 37 °C.

3. Entfernen Sie 1 ml uninduzierte Probe. Zentrifugieren und Überstand entfernen. Einfrieren oder auf Eis lagern, bis SDS-PAGE ausgeführt werden kann.

4. Fügen Sie IPTG zu einer Endkonzentration von 1 mM hinzu und wachsen Sie weitere 2-3 h.

5. 1 ml induzierte Probe entnehmen. Zentrifugieren und Überstand entfernen. Einfrieren oder auf Eis lagern, bis SDS-PAGE ausgeführt werden kann.

6. Die Zellpellets in 200 µl SDS-PAGE Probenpuffer resuspendieren; 3-5 min auf 90 °C erhitzen.

7. Analysieren Sie 5-10 µl mit SDS-PAGE, gefolgt von Coomassie-Blaufärbung (oder 1-2 µl für Western Blot).

7proben, die in Minikulturen gezüchtet wurden, können auch verwendet werden, um die Löslichkeit eines bestimmten Fusionsproteins zu bewerten (siehe Anmerkung 6 zum Minikultur-Expressionsprotokoll). Am Ende der Induktionsperiode die Zellen durch Zentrifugation ernten. Resuspendieren Sie das Pellet in 200 µl kaltem PBS. Lysieren Sie die Zellen mit Ultraschall; Halten Sie die Probe auf Eis. Speichern Sie ein kleines Aliquot des Lysats zur Analyse per SDS-PAGE. Zentrifugieren Sie die lysierte Probe für 15 min. Entfernen Sie den Überstand in ein separates Röhrchen. Resuspendieren Sie das Pellet in 200 µl PBS. Analysieren Sie einen Teil des Rohlysats, den Überstand und das resuspendierte Pellet durch SDS-PAGE oder Western Blotting. Wenn die Probe sowohl in der Lysat- als auch in der Überstandfraktion beobachtet wird, ist die Probe ausreichend löslich. Wenn die Probe hauptsächlich im Lysat und im resuspendierten Pellet vorhanden ist, befindet sich die Probe höchstwahrscheinlich in Okklusionskörpern. In Fällen, in denen sich das Protein in Einschlusskörpern befindet, untersuchen Sie verschiedene Expressionsbedingungen, um die Expression in eine lösliche Form zu verschieben (siehe Anmerkung 8).

8wird das Fusionsprotein primär in Einschlusskörpern exprimiert (z.B. >80% unlöslich) können verschiedene Strategien zur Verbesserung der Löslichkeit eingesetzt werden. Häufig ist die Induktion bei niedrigerer Temperatur (15-25 ° C) wirksam bei der Verschiebung der Expression von Einschlusskörpern in die lösliche Fraktion. Zellen, die bei dieser niedrigeren Temperatur induziert werden, wachsen langsamer und benötigen Induktionsperioden über Nacht. Die Verwendung alternativer Wirtsstämme oder Modifikationen des Plasmidkonstrukts kann in einigen Fällen notwendig sein. Wenn das Fusionsprotein auch nach Versuchen, lösliches Protein zu erhalten, hauptsächlich in Einschlusskörpern verbleibt, kann es sich lohnen, die Produktion von E zu erhöhen. coli und reinigen genug Protein aus der geringen Menge an löslichem Protein, das verfügbar ist. In einigen Fällen sollten andere Fusionsprotein-Tags untersucht werden.

9 Niedrige Proteinexpressionsniveaus könnten das Ergebnis einer seltenen Codonverwendung sein. In diesem Fall kann der Wechsel zu einem anderen Stamm von E. coli, der zusätzliche Transkripte für seltene Codon-tRNA enthält, die Proteinproduktion signifikant verbessern. Unterschiedliche Medienformulierungen oder die Zugabe von bis zu 2% Glucose können ebenfalls die Expression verbessern (13, 14). Wenn der Verdacht besteht, dass das exprimierte Protein für die Zellen toxisch ist (normalerweise hören sie nach Induktion mit IPTG auf zu wachsen), versuchen Sie, zu einem späteren Zeitpunkt für eine kürzere Zeit zu induzieren. Die Verringerung der IPTG-Konzentration ist eine weitere Option, die untersucht werden sollte.

10überwachen Sie das Zellwachstum durch Ablesen der optischen Dichte bei 600 nm (A600). Eine Übernachtungskultur sollte einen A600 ~ 1-1,2 erreichen. Zellen sollten in einer frühen Phase der logarithmischen Wachstumskurve für E. coli, A600 ~ 0,5 bis 0,7 induziert werden. Bei 37 ° C dauert es ungefähr 2 h, bis die Kulturen ein frühes Log-Wachstumsstadium erreichen. Wenn Zellen bei einer niedrigeren Temperatur gezüchtet werden, muss die Inkubationszeit erhöht werden, da die Zellen bei niedrigeren Temperaturen langsamer wachsen. Im Allgemeinen wird die größte Ausbeute an Fusionsprotein erhalten, wenn die Zellen bei A600 = ~ 0,5 induziert werden. Nach Induktion mit IPTG lautet eine allgemeine Richtlinie für die Inkubationszeit wie folgt: 3 h bei 37 ° C, 5 h bei 30 ° C und über Nacht bei 25 ° C oder darunter. Ernten Sie die Zellen vor der Sättigung, A600 ~ 1.0-1.2.

11um eine ausreichende Belüftung zu gewährleisten, sollten die Kolben nur zu 20-30% ihres Fassungsvermögens gefüllt werden.

12es ist wichtig, dass vor der Spaltung mit Thrombin oder Faktor Xa keine Serinproteaseinhibitoren in der Probe vorhanden sind. Die folgenden Proteaseinhibitoren müssen vor der Thrombin- oder Faktor-Xa-Spaltung entfernt werden: AEBSF, APMSF, Antithrombin III, Antipain, α1-Antitrypsin, Aprotinin, Chymostatin, Hirudin, Leupeptin und PMSF. Darüber hinaus ist Pefabloc TH-Benzamidin spezifisch für Thrombin und Pefabloc FXa spezifisch für Faktor Xa. Die folgenden Proteaseinhibitoren sollten bei verschreibungspflichtiger Protease vermieden werden: 100 mM ZnCl2, 100 µM Chymostatin und 4 mM Pefabloc.

13es gibt eine Reihe alternativer Methoden zum Nachweis von GST-Fusionsproteinen. Für Proteine, die auf hohem Niveau gut exprimieren, ist die einfachste Methode zur Überwachung der Reinigung über SDS-PAGE-Gele, die mit Coomassie-Blau- oder Silberfärbung gefärbt sind. Eine Alternative für Proteine, die in niedrigen Konzentrationen exprimieren, ist die Verwendung von Western Blotting unter Verwendung eines Antikörpers, der entweder auf GST oder das Zielprotein gerichtet ist. Eine Alternative für kleine Expressionen besteht darin, das Vorhandensein von GST mit einem ELISA- oder CDNB-Enzymtest zu überwachen.

14speichern Sie eine kleine Menge Proteinprobe aus jedem Schritt der Reinigung, einschließlich Lyse, Überstand, Pellet, ungebundenen Fraktionen aus der Probenbeladung, Waschschritten und Elutionsschritten, die durch SDS-PAGE oder Western Blotting analysiert werden sollen. Nachdem alle Proben analysiert und gepoolt wurden, verwerfen Sie unerwünschte Fraktionen.

15GST-Proteine können auch mit einer Batch-Reinigungsmethode gereinigt werden. Eine Batch-Reinigungsmethode ist schnell, einfach und erfordert wenig Ausrüstung; das resultierende Protein kann jedoch mehr Verunreinigungen enthalten und eine geringere Ausbeute aufweisen als eine chromatographiebasierte Reinigung. Batch-Reinigungen werden am besten beim Screening von Reinigungsbedingungen verwendet. Die nachfolgend skizzierte Batch-Reinigung wird im Allgemeinen bei Raumtemperatur durchgeführt. Um das Risiko eines proteolytischen Abbaus zu minimieren, kann das Verfahren bei 4 ° C durchgeführt werden, indem die Inkubationszeit um das 2- bis 4-fache erhöht wird.

1. Zellen lysieren und lösliches Fusionsprotein erhalten (siehe Anmerkungen 8 und 21, wenn sich die Probe in Einschlusskörpern befindet).

2. 2 ml 50% Slurry Glutathion Sepharose Bulk Matrix (1 ml Bettvolumen) pro 100 ml Bakterienlysatüberstand zugeben. 30 min bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren inkubieren.

3. Zentrifuge 500 × g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und speichern Sie ihn für die Analyse mit SDS-PAGE, um die Bindungseffizienz zu bestimmen.

4. Waschen Sie das Harz mit 100 Volumina PBS. Vorsichtig resuspendieren und dann 500 × g für 5 min zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie die Wasch- und Zentrifugationsschritte für insgesamt 3 Wäschen mit jeweils 10 Bettvolumina.

5. Eluieren Sie das Fusionsprotein durch Resuspendieren des Harzes mit 1,0 ml Glutathion-Elutionspuffer pro ml Bettvolumen. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren. Zentrifuge 500 × g für 5 min. Übertragen Sie den fusionsproteinhaltigen Überstand in ein separates Röhrchen. Elutions- und Sammelschritte insgesamt 3 mal wiederholen. Die Überstände können durch SDS-PAGE zusammengefasst oder separat analysiert werden, um den Proteingehalt zu überwachen (siehe Anmerkung 12).

Das 16A-Bettvolumen entspricht der Hälfte der 50% igen Aufschlämmung von Glutathionsepharose 4B, die zur Reinigung verwendet wird. So bereiten Sie eine 50% ige Aufschlämmung von Glutathionsepharose vor (sie wird als ~ 75% ige Aufschlämmung geliefert): Bestimmen Sie das für die Reinigungsskala erforderliche Bettvolumen. Resuspendieren Sie die Glutathionsepharose 4B. Für jeden ml des erforderlichen Bettvolumens pipettieren Sie 1,33 ml der 75% igen Aufschlämmung in ein Zentrifugenröhrchen geeigneter Größe. Zentrifugieren bei 500 × g für 5 min. Dekantieren Sie den Super. Waschen Sie mit 10 Bettvolumina (10 ml pro 1,33 ml Originalaufschlämmung) PBS, indem Sie das Röhrchen mehrmals vorsichtig umdrehen, um es zu mischen, und zentrifugieren Sie dann 500 × g für 5 min. Dekantieren Sie den Super. Wenn die Ethanolspeicherlösung nicht entfernt wird, können nachfolgende Bindungsschritte beeinträchtigt werden. Fügen Sie 1 ml PBS für jede 1,33 ml der ursprünglichen Aufschlämmung hinzu. Dies führt zu einer 50% igen Aufschlämmung.

17glutathionsepharose hat eine angekündigte Mindestbindungskapazität von 8 mg/ml. Eine 20 ml-Säule sollte ausreichen, um Protein aus 3 × 600 ml E. coli-Kulturen zu reinigen, die ~ 20-40 mg Fusionsprotein pro Kultur enthalten. Sowohl die Menge des verwendeten Harzes als auch die Säulengröße können in Abhängigkeit von der Menge des zu reinigenden Proteins nach oben oder unten skaliert werden.

18resuspendieren Sie das Pellet mit 25-50 µl Waschpuffer pro ml Originalkultur.

19die Unterbrechung ist abgeschlossen, wenn sich die Suspension teilweise auflöst und eine etwas dunklere Farbe annimmt. Vermeiden Sie ein Aufschäumen während der Beschallung, da dies zu einer Denaturierung des Fusionsproteins führen kann. Vermeiden Sie eine Übersonikation, da dies zusammen mit dem GST-Fusionsprotein zur Ko-Reinigung von Wirtsproteinen von E.coli führen kann. Die hohe Viskosität aufgrund der Freisetzung von Nukleinsäuren während der Beschallung kann durch Zugabe von DNase oder Benzoase zum Lysepuffer verringert werden. Lysozym bis zu einer Konzentration von 0.2 mg/ml können als Hilfe zur Zelllyse zugesetzt werden. Eine Alternative zur Beschallung ist die Verwendung von kommerziell erhältlichen Zellextraktionsformulierungen. Diese Produkte können jedoch proprietäre Komponenten enthalten, die nachgelagerte Anwendungen stören.

20 Wenn Versuche, die Expression von Einschlusskörpern in die lösliche Fraktion zu verlagern, fehlschlagen, können unlösliche GST-Fusionsproteine manchmal in Gegenwart von Denaturierungsmitteln wie Harnstoff gereinigt und anschließend wieder gefaltet werden. Auch die Solubilisierung mit Detergenzien wie Sarkosyl (N-Laurylsarosin) wurde erfolgreich eingesetzt (15, 16). Obwohl das folgende Protokoll erfolgreich zur Denaturierung und Re-Naturation von GST-Fusionsproteinen verwendet wurde, ist jedes Fusionsproteinkonstrukt einzigartig und die genauen Denaturierungs- und Re-Naturationsbedingungen müssen empirisch bestimmt werden. Übliche Denaturierungsmittel, die erfolgreich eingesetzt wurden, umfassen Guanidin-HCl, Harnstoff, Tween 20, CTAB und SDS (17, 18). Die Denaturierungsmittel müssen dann vollständig entfernt werden, um eine ordnungsgemäße Rückfaltung des Proteins zu ermöglichen. Zu den Bedingungen, die optimiert werden sollten, um das Umklappen zu erleichtern, gehören: art des Denaturierungsmittels, pH-Wert, Vorhandensein des Reduktionsmittels, Geschwindigkeit der Denaturierungsmittelentfernung und Proteinkonzentration. Sobald das Protein re-natured worden ist, überprüfen Sie, ob das Protein seine gebürtige Anpassung und Funktion wiedergewonnen hat und entfernen Sie jedes unsachgemäß gefaltete Protein.

1. Die Glutathionsepharosesäule voräquilibrieren; die pelletierten E. coli-Zellen beschallen und den Lysatüberstand und die Pelletfraktionen durch Zentrifugation trennen (siehe 3.3 Affinitätsreinigung von GST-Fusionsprotein Schritte 1-8). Resuspendieren Sie das Lysatpellet, das die Einschlusskörper enthält, in 15 ml Waschpuffer. 20 min bei 48.000 × g (4 °C) zentrifugieren. Dekantieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das gewaschene Pellet in 12 ml U-Puffer (resuspendieren Sie in 20 µl U-Puffer pro ml Originalkultur). 2 h auf Eis inkubieren.

2. 20 min bei 48.000 × g (4 °C) zentrifugieren. Überführen Sie den Überstand, der das denaturierte Fusionsprotein enthält, in ein sauberes Zentrifugenröhrchen.

3. Triton X-100 bis zu einer Endkonzentration von 1% zum Überstand geben.

4. Dialysieren Sie die Probe für 2-3 h in PBS / Glycerin. Das Volumen des Dialysepuffers sollte mindestens das 20-fache des Probenvolumens betragen.

5. Dialysieren Sie die Probe über Nacht im Vergleich zu PBS mit Proteaseinhibitoren unter Verwendung eines Puffervolumens, das das 100-fache des Probenvolumens > beträgt.

6. Die Probe aus der Dialyse nehmen und 20 min bei 4.000 × g zentrifugieren.

7. Extrahiertes und wieder naturiertes Protein aus den Einschlusskörpern kann nun auf Glutathionsepharosesäulen aufgebracht und gereinigt werden.

Lösungen:

Waschpuffer: 50 mm Tris, 5 mM EDTA, 1 µg/ml Leupeptin, 1 µg/ml Pepstatin, 0,15 mm PMSF, pH 8,0

U-Puffer: 5 M Harnstoff, 50 mM Tris, 5 mM EDTA, 5 mM 2-ME, 1 µg/ml Leupeptin, 1 µg/ml Pepstatin, 0,15 mm PMSF, 1 mM DFP pH 8,0

PBS/Glycerin: 1X PBS, 20% Glycerin, 1% Triton X-100, 5 mM 2-ME, 5 mM EDTA, 5 mM 2- ME, 1 µg/ml Leupeptin, 1 µg/ml Pepstatin, 0,15 mM PMSF, 1 mM DFP pH 7,4

21es wird empfohlen, eine Schlauchpumpe zu verwenden, um die Durchflussraten gleichmäßig zu steuern. Wenn eine Kompression des Harzes auftritt, ist der Druck zu hoch und die Flussrate sollte reduziert werden.

22Die Bindungskinetik zwischen Glutathion und GST ist relativ langsam. Daher ist es wichtig, niedrige Flussraten zu verwenden, um eine maximale Bindekapazität zu erreichen, z. B. 0,1 ml / min für eine 2,5-cm-ID-Säule. Die Verwendung von zu schnellen Flussraten kann die Menge an gebundenem Fusionsprotein aufgrund der langsamen Assoziationskinetik verringern. Wasch- und Elutionsschritte können mit schnelleren Durchflussraten durchgeführt werden, um Zeit zu sparen (1,5 ml / min bzw. 0,3 ml / min). Bei großvolumigen Proben wird die Bindung am bequemsten über Nacht durchgeführt, wobei die Durchflussraten so eingestellt werden, dass die Säule nicht trocken läuft.

23die Analyse der ungebundenen Fraktionen zeigt an, ob das Fusionsprotein bindet oder nicht. Wenn das Protein nicht in frühen Fraktionen nachgewiesen wird, sondern in späteren Fraktionen auftritt, zeigt dies an, dass die Säulenkapazität überschritten wurde. Eine Verringerung der Proteinbelastung oder eine Erhöhung der Säulengröße lindert diesen Zustand.

24wenn das Fusionsprotein schlecht an die Glutathionsepharose bindet, gibt es mehrere Alternativen, um die Bindungseffizienz zu erhöhen. Versuchen Sie eine mildere Lysemethode. Wenn die verwendete Methode zu hart ist, kann das Protein denaturiert werden und daher nicht in der Lage sein, an die Säule zu binden. Wenn Sie das Protein aus Einschlusskörpern renaturieren, stellen Sie außerdem sicher, dass alle Denaturierungsmittel aus dem Puffer entfernt wurden, entweder durch erschöpfende Dialyse oder Aufbringen der Probe auf eine Entsalzungssäule, bevor Sie auf die Glutathionsäule aufgetragen werden. Entfernen Sie die Ethanolspeicherlösung von der Glutathionsepharose; Reduzieren Sie die Säule mit frischem Glutathionpuffer, gefolgt von einer Wäsche mit PBS unmittelbar vor der Probenbeladung. Erhöhen Sie die Harzmenge und / oder verringern Sie die Flussrate, die zum Laden der Probe verwendet wird. Versuchen Sie, der Probe 1-20 mM DTT hinzuzufügen. Wenn ein Problem weiterhin besteht, reinigen Sie die Säule gemäß den Empfehlungen des Herstellers. Wenn die Bindung immer noch nicht wiederhergestellt ist, versuchen Sie es mit frischem Harz.

25Die Ausbeute an Fusionsprotein kann auch durch Messung der Absorption bei 280 nm (A280) geschätzt werden. Der Extinktionskoeffizient für die GST-Einheit allein beträgt ~ 1,5, d. H. 1,00 A280 = ~ 0.6 mg / ml Protein, obwohl der Extinktionskoeffizient für das Fusionsprotein teilweise von den Absorptionseigenschaften des Zielproteins abhängt.

26wenn ein Problem beim Eluieren des Proteins aus der Glutathionsepharosesäule auftritt, versuchen Sie, die Flussrate zu verringern und das Volumen des verwendeten Elutionspuffers zu erhöhen. Achten Sie darauf, frischen reduzierten Glutathionpuffer zu verwenden (machen Sie es zu dem Tag, an dem es verwendet wird). Erhöhen Sie die Konzentration von Glutathion bis zu 40 mM und / oder erhöhen Sie den pH–Wert des Puffers auf pH 8,0-9,0. Fügen Sie dem Puffer 1-20 mM DTT (oder ein anderes Reduktionsmittel) hinzu. Die Zugabe eines nichtionischen Detergens kann auch die Solubilisierung verbessern und eine eventuell auftretende Aggregation minimieren.

27die Kontamination des gereinigten Fusionsproteins mit E. coli-Wirtszell-Proteinen ist ein Hinweis darauf, dass die Beschallung zu stark war. Wenn abgebaute Fragmente des Fusionsproteins vorhanden sind, versuchen Sie, dem Lysepuffer zusätzliche Proteaseinhibitoren hinzuzufügen. Halten Sie alle Proben, Puffer und Sammelröhrchen kalt, um die Proteolyse zu minimieren. Wenn während der Proteinexpression ein Abbau auftritt, versuchen Sie, die Probe spät zu induzieren (~ 0.8 OD600) und verringern die Länge der Induktionsperiode. Der Wechsel zu einem alternativen Wirtsstamm kann ebenfalls hilfreich sein.

28eine Alternative zum In-Solution-Digestion ist die Proteasespaltung des Fusionsproteins, während es an die Glutathion-Sepharose-Matrix gebunden ist. Das Fusionsprotein wird extrahiert und auf die Glutathionsepharose geladen, gefolgt von Waschen mit PBS (siehe Affinitätsreinigung von GST-Fusionsprotein, Schritte 1-11). Anstatt das Protein mit Glutathionpuffer zu eluieren, wird eine PBS-Lösung, die das Enzym enthält, auf die Säule geladen und mehrere Stunden bei Raumtemperatur (4 ° C für Prescissionsprotease) inkubiert. Das gespaltene Protein wird dann mit mehreren Säulenvolumina PBS aus der Säule ausgewaschen. Restliches Fusionsprotein und die GST-Einheit können aus der Säule entfernt werden, indem die Säule mit reduziertem Glutathionpuffer gewaschen wird. Die Enzymmenge und die Inkubationszeit müssen für jedes Fusionsprotein empirisch bestimmt werden. Analysieren Sie alle Proben mit SDS-PAGE, um die Spalteffizienz und Proteinreinheit zu bestimmen.

29zu dem an das Harz gebundenen Fusionsprotein wird in einer Batch-Proteasespaltung eine empirisch bestimmte Menge Enzym zugegeben (siehe Anmerkung 15 a–d). Verwenden Sie 1 ml PBS-haltiges Enzym pro ml Bettvolumen. Bei Raumtemperatur mehrere Stunden unter leichtem Rühren inkubieren. Zentrifugieren Sie 500 × g für 5 min, um das Harz zu sedimentieren. Entfernen Sie das Röhrchen, das das Zielprotein enthält, in ein separates Röhrchen. Waschen Sie die Glutathionsepharose mit PBS bis zu 3 Mal, um das gespaltene Fusionsprotein wiederherzustellen. Inkubieren Sie das Harz mit Glutathionpuffer, um GST und restliches Fusionsprotein zu entfernen. Verwenden Sie 1 ml Glutathionpuffer pro ml Harz. 500 × g zentrifugieren und eluiertes GST zurückgewinnen. Wiederholen Sie bis zu 3 mal. Analysieren Sie Proben von SDS-SEITE.

30bei Verwendung von Thrombinprotease kann der Aufschluss in dem Glutathionpuffer erfolgen, der zur Elution des Proteins aus der Säule verwendet wird. Bei Verwendung von Faktor Xa wird empfohlen, das Protein vor der Verdauung entweder in einen Tris-Puffer oder in einen PBS-Puffer zu dialysieren; das im Elutionspuffer vorhandene Glutathion kann die in Faktor Xa vorhandenen Disulfidbrücken stören, was zu einem ineffizienten Aufschluss des Fusionsproteins führt. Eine empirische Bestimmung der Verdauungsbedingungen für jedes Fusionsprotein muss in einem Pilotverdauungsexperiment bestimmt werden. Eine bequeme Methode besteht darin, 100 µg Fusionsprotein über einen Bereich von Enzym-zu-Substrat-Verhältnissen zu verdauen und die Inkubationszeit zu variieren. Typische Inkubationszeiten liegen zwischen 2 und 8 Stunden. Empfohlene Enzym-Substrat-Verhältnisse für Thrombin sind 1:100, 1:350, 1:1000, und 1:3000 (Einheiten Enzym pro µg Fusionsprotein) und für Faktor Xa 1:10, 1:25, 1:50, 1:100, 1:300 ( µg Enzym pro µg Fusionsprotein). Entfernen Sie zu den gewünschten Zeitpunkten 2 µg Protein und stoppen Sie die Verdauung, indem Sie das Probenaliquot in den SDS-Probenpuffer geben. Analysieren Sie die Proben per SDS-PAGE, um die optimalen Spaltbedingungen zu bestimmen. Zusätzlich zum Enzym-zu-Substrat-Verhältnis und der Zeit sollten Sie die Pufferbedingungen ändern, z. B. die NaCl-Konzentration erhöhen oder verringern oder dem Puffer Ca2 + hinzufügen (Tipps zur Fehlerbehebung finden Sie in Anmerkung 31).

31wenn mehrere Banden auf der SDS-PAGE für das Zielprotein nach der Verdauung beobachtet werden, überprüfen Sie die Zielproteinsequenz auf potenzielle sekundäre Protease-Erkennungsstellen. Wenn sekundäre Spaltstellen vorhanden sind, klonen Sie erneut in einen anderen Vektor. Wenn keine Spaltung beobachtet wird, überprüfen Sie die DNA-Sequenz, um das Vorhandensein und die Integrität der erwarteten Proteasespaltungsstelle zu überprüfen. Stellen Sie sicher, dass Proteaseinhibitoren vollständig aus dem Puffer entfernt wurden. Fügen Sie mehr Enzym hinzu und / oder erhöhen Sie die Inkubationszeiten über Nacht. Wenn der Aufschluss bei den höchsten Enzym-zu-Substrat-Verhältnissen und längsten Zeitpunkten unvollständig bleibt, erwägen Sie, die Proteasespaltungsstelle so umzugestalten, dass mehrere Glycine zwischen der GST-Einheit und dem Zielprotein eingeschlossen werden, um die Wahrscheinlichkeit einer sterischen Behinderung zu verringern, die die Spaltung stört (19, 20).

32wenn eine Hemmung des Enzyms nach vollständigem Aufschluss unter Verwendung von Serinproteaseinhibitoren unerwünscht ist, kann die Probe auf eine HiTrap-Benzamidinsäule aufgebracht werden, um das Enzym aus der Probe zu entfernen.

33wenn die Probe auf der Glutathionsepharosesäule erneut chromatographiert werden soll, um GST und unverdautes Fusionsprotein zu entfernen, ist es entscheidend, dass das reduzierte Glutathion vollständig aus der Probe entfernt wird. Glutathion gleicht sich sehr langsam über Dialysemembranen aus; Wenn daher Dialyseschläuche mit einem MWCO < 12.000 verwendet werden, können 3 oder mehr Pufferwechsel für die vollständige Entfernung erforderlich sein. Eine erhöhte Dialysezeit (über Nacht) und ein größeres Puffervolumen können auch für große Probenvolumina erforderlich sein.

34die gleiche Glutathionsepharosesäule kann sowohl zur initialen Isolierung des Fusionsproteins als auch zur Nachreinigung nach enzymatischer Spaltung verwendet werden. Es wird empfohlen, eine einzelne Säule einem einzelnen Proteinkonstrukt zu widmen, um eine mögliche Kreuzkontamination verschiedener rekombinanter Proteine zu vermeiden. Spalten können mehrfach wiederverwendet werden. Wenn die Bindungseffizienz im Laufe der Zeit abnimmt, reinigen Sie die Säule gemäß den Empfehlungen des Herstellers. Wenn die Bindungsaktivität nicht wiederhergestellt wird, sollte eine neue Spalte verwendet werden.

35maximale Bindung tritt auf, wenn die Säule vollständig reduziert ist; wenn die Glutathionsepharosesäule jedoch weniger als 48 h vor diesem Schritt gewaschen wurde, kann dieser Schritt übersprungen werden.

36Das Zielprotein befindet sich in der ungebundenen Fraktion und das GST und jedes nicht gespaltene Fusionsprotein binden an die Säule.

37kleine Probenvolumina werden für eine gute Auflösung des Zielproteins im Vergleich zu anderen Kontaminanten empfohlen. Wenn es nicht möglich ist, die Probe in ein kleines Volumen zu konzentrieren, können mehrere Injektionen der Probe durchgeführt werden.