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CPV-2 ist der Hauptverursacher der viralen Gastroenteritis bei Hunden. Es gehört zur Familie der Parvoviridae und gehört zur Gattung Protoparvovirus und zur Art Protoparvovirus Typ 1. Es handelt sich um ein nicht umhülltes Virus mit einem einzelsträngigen DNA-Genom, das für zwei Kapsidproteine, VP1 und VP2, kodiert, die für den Zusammenbau und die Verpackung des viralen Genoms erforderlich sind, sowie für NS1- und NS2-Nichtstrukturproteine, die an der Kontrolle der DNA-Replikation, des Zusammenbaus und der Regulation der Genexpression beteiligt sind .

In den letzten Jahren hat CPV-2 neue antigene Varianten entwickelt. 1980 wurde der ursprüngliche CPV-2-Stamm durch die Variante Typ 2a (CPV-2a) ersetzt, 1984 wurde CPV-2b identifiziert und 2001 wurde CPV-2c in Italien nachgewiesen und gemeldet. Die letzte Variante wurde ebenfalls identifiziertin Asien, Afrika und Amerika. Aufgrund der Existenz mehrerer antigener Varianten für CPV-2 können die klinischen Symptome stark variieren .In der Folge haben Tierärzte weniger Sicherheit bei der Erteilung ihrer vorläufigen Diagnose, und in der Regel sind einige Labortests erforderlich, umbestätigen ihre Diagnose; obwohl mehrere Techniken in Forschungslabors entwickelt wurden, wie Hämagglutinationstests, Immunfluoreszenz, ELISA, PCR,Immunochromatographie-Test und Zellkultur (unter anderem), tatsächlich Techniken mit der größten Verfügbarkeit in klinischen Labors in Tierkliniken sind nur der Immunochromatographie-Test und PCR, jedoch in der Forschung über die Empfindlichkeit und Spezifität dieser Verfahren sind die Berichte umstritten.Darüber hinaus wurden bei Patienten mit unterschiedlichem Schweregrad der Erkrankung die Sensitivität und Spezifität dieser Techniken nicht umfassend untersucht.

Das Ziel dieser Studie ist es, die Vor- und Nachteile des Immunochromatographietests und der PCR für die Diagnose von Patienten mit einer großen Vielfalt klinischer Symptome für CPV-2.

Diese Studie wurde gemäß den Richtlinien der Experimental Animal Research Mexican Official Norm NOM-062-ZOO-1999 durchgeführt.

Hunde mit klinischer Enteritis, die in der Tierklinik für Kleintiere der Universidad Autónoma de Estado de México hospitalisiert waren, wurden für diese Studie gescreent und basierend auf positiv oder negativ getestetem CPV-2 unter Verwendung von Nested PCR (nPCR) ausgewählt. Als Ergebnis wurden 45 Hunde, die positiv getestet wurden, ausgewählt, und 5 negativ getestete Hunde wurden als Kontrollen eingeschlossen. Die 50 Hunde wurden von drei Tierärzten gleichzeitig klinisch untersucht, um die Empfindlichkeit der klinischen Diagnose zu erhalten. Jeder Tierarzt gab seine vermutliche Diagnose auf diskrete Weise unter Verwendung der problemorientierten veterinärmedizinischen Akte (POVMR) als Diagnosewerkzeug aus.

Als nächstes wurden Stuhlproben aller Hunde durch PCR und Immunochromatographie-Test analysiert, während Blutproben verwendet wurden, um ein vollständiges Blutbild durchzuführen.

nPCR gilt als eine hochzuverlässige und empfindliche Technik zur Identifizierung von CPV-2-Viruspartikeln , und daher korrelierte in dieser Studie die Empfindlichkeit der verwendeten Tests mit denen, die zuvor von nPCR für die CPV-2-Diagnose erhalten wurden.

Hundestuhlproben wurden mit Rektalabstrichen gewonnen, die in nukleasefreiem Wasser und 200 µl der Homogenate suspendiert und zur DNA-Extraktion verwendet wurden. Das Verfahren wurde unter Verwendung des QIAamp® DNA Stool DNA extraction Kit (QIAGEN, Mainz, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Alle DNA-Proben wurden mit einem Quawell-Spektralphotometer Q5000 (Quawell Technology, Inc., San Jose, CA, USA). 100 ng DNA jeder Probewurden für PCR-Reaktionen mit 50 µl Endvolumen verwendet. Zuvor wurde in unserem Labor ein Primerpaar entwickelt, um ein 275-bp-Fragment, ParvoInt2FB (5′-TCAAGCAGATGGTGATCCAAG-3′) und ParvoInt2CR (5’–GGTACATTATTTAATGCAGTTA–3′), zu amplifizieren befindet sich an den Nukleotiden 1,107-1,130 und 1,360-1,382 des VP2-Gens (GenBankaccession number FJ0051962c).

PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung von 2 µl jedes Primers (200 nM), 12,5 µl GoTaq® Green Master Mix (Promega, Madison, WI, USA) enthaltend DNA-Polymerase, Reaktionspuffer (pH 8,5) und 400 µM jedes Nukleotids (dATP, dGTP, Dctp und dTTP); 3 mm MgCl2 durchgeführt.und 28.5 µl nukleasefreies Wasser. Alle Reaktionen wurden unter den folgenden Amplifikationsbedingungen durchgeführt; 1 Zyklus bei 94 ° C für 5 min zur anfänglichen Denaturierung, gefolgt von 35 Zyklen bei 94 ° C für 30 sec, 52 ° C für 1 min, 72 ° C für 1 min und einem abschließenden Verlängerungszyklus bei 72 ° C für 5 min.

nPCR wurde zunächst unter Verwendung von ParvoExt1f (5′-ATGAGTGATGGAGCAGTTCA-3′)- und ParvoExt3R (5′-AGGTGCTAGTTGAGATTTTTCATATAC–3′) -Primern mit einem Fragment von 1.740 bp amplifiziert und unter Verwendung der Nukleotidsequenzen 1-20 und 1.712-1.740 aus dem Gen VP2 parvovirus (GenBank-Zugangsnummer FJ0051962c). Die Reaktion wurde auf ein Endvolumen von 50 µl normiert.

Der Reaktionsansatz enthielt 1 µl GoTaq® Flexi DNA Polymerase 5 U/µl (Promega), 5 µl GoTaq® Flexi buffer 5XGreen, 3 µl MgCl2 25 mM, 4 µl dNTP’s 200 µM, 2 µl Primer, 10 µl DNA mit einer Endkonzentration von 100 ng und 23 µl nukleasefreies Wasser. Die Reaktion wurde unter folgenden Amplifikationsbedingungen durchgeführt: 1 Zyklus bei 94°C für 5 min, gefolgt von 35 Zyklen bei 94°C für 30 sec, 50°C für 45 sec, 72°C für 1 min und 1 Zyklus bei 72°C für 5 min. Anschließend wurde 1 µl des Produkts dieser Reaktion als DNA-Template für das Nesting-Verfahren verwendet, und Primer und Amplifikationsbedingungen waren für 275 bp Fragment gleich.

Alle Amplifikationsprodukte wurden durch horizontale Elektrophorese in 2% igen Agarosegelen identifiziert, die mit 0,5 µg / ml Thidiumbromid gefärbt und mit einem UV-Transilluminator sichtbar gemacht wurden.

Für die Analyse des immunochromatographischen Tests auf canines Parvovirus (CPV Ag) wurde das ANIGEN® Kit (Bionote Inc., Gyeonggi-do, Korea) verwendet. Jeder testwurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.

Blutproben wurden aus der Halsvene unter Verwendung von Vacutainer-Röhrchen mit EDTA als Antikoagulans entnommen. Das vollständige Blutbild (CBC) wurde mit einem automatischen Zellzähler (QBC) durchgeführt-IDEXX Laboratories, Inc., Westbrook, ME, USA). Die Blutfilme wurden mit Wright-Giemsa angefärbt und unter einem Photonikmikroskop untersucht. Leukopenie wurde in Betracht gezogen, wenn die Gesamt-CBC-Zahl weniger als 6 × 103 / µl betrug .

Die Ergebnisanalyse wurde unter Verwendung einer Matrix für codierte Variablen durchgeführt , und es wurden Kontingenztabellen erstellt, um die Eigenschaften des Diagnosetests zu bestimmen . Darüber hinaus wurde die Kappa-Statistik bestimmt, um die Übereinstimmung zwischen den drei verwendeten Tests und der nPCR zu bewerten. Der Kappa-Wert wurde 2015 nach Kantere und Kollegen charakterisiert, wobei der Kappa-Wert 1 absolute Übereinstimmung anzeigt, während ein Wert von 0 anzeigt, dass die Übereinstimmung zufällig auftritt. Im Allgemeinen weisen Kappa-Werte über 0,6 auf ein gutes Übereinstimmungsniveau hin; Die Analyse wurde mit dem Statistikpaket SPSS Ver. 22.0 (IBM, Inc., Armonk, NY, USA).

Einundneunzig Punkt ein (91,1) % der positiven Hunde für CPV-2 durch nPCR waren reinrassig; 95.5% der Patienten waren zwischen zwei und acht Monaten alt und 4,5% waren älter als ein Jahr. In Bezug auf ihren Impfstatus wurden 40% mindestens einmal geimpft, um eine CPV-2-Infektion zu verhindern.

Die Häufigkeit der klinischen Symptome dieser Hunde war wie folgt: 44,4% zeigten Erbrechen und Durchfall; 20% hatten Fieber, Erbrechen und Durchfall (katarrhalisch oder hämorrhagisch); 17,7% zeigten nur Durchfall; 8,8% zeigten nur Erbrechen; und 4,4% hatten Durchfall und Fieber, und 4,4% zeigten Erbrechen und Fieber.Leukopenie wurde bei 48,8% der Hunde beobachtet (Tabelle 1).

Bei der klinischen Untersuchung diagnostizierten Tierärzte nur 57,8% der CPV-2–positiven Patienten und 100% der negativen Hunde; Daher wurde der Sensitivitätswert für die klinische Diagnose auf 57,7% (KI0,95 42,2–72) und die beobachtete Spezifität auf 100% (KI0,95 46,2-98,8) geschätzt.

In Bezug auf die Diagnose von Labortests waren von 100% der Hunde, die durch nPCR positiv waren, nur 30/45 dieser Patienten CPV-2-positiv durch Immunochromatographie-Test, während die fünf Kontrollpatienten, die negativ auf CPV-2 getestet wurden, korrekt diagnostiziert wurden. Daher zeigte diese Technik eine Sensitivität von 66,6% (KI0,95 50,9–79,5) und die beobachtete Spezifität betrug 100% (KI0,95 46,2–98,8).

Unter Verwendung der PCR-Technik waren 36/45 Patienten positiv gegenüber CPV-2 und die fünf Kontrollpatienten wurden während der gesamten nPCR negativ bestätigt. So zeigte die PCR eine Empfindlichkeit von 80% (KI0,95 63,1–87,7) und eine Spezifität von 100% (KI0,95 67,8–99,1) (Abb. 1).

Die Übereinstimmung zwischen den drei Techniken wird durch den Kappa-Wert demonstriert (Tabelle 2).

Gastroenteritis, die durch CPV-2 verursacht wird, gilt als eine der wichtigsten Viruserkrankungen, die Hunde betreffen. Obwohl die klinischen Anzeichen einer Infektion mit dem caninen Parvovirus variieren können, waren die am häufigsten berichteten Anzeichen: Anorexie, Depression, Lethargie, Fieber , schleimiger und hämorrhagischer Durchfall und Leukopenie ; In subklinischen Fällen können einige dieser Anzeichen vorliegen oder nicht .

Während der klinischen Untersuchung wurde eine Variabilität der klinischen Manifestationen einer Infektion beobachtet. Nur 20% der untersuchten Hunde zeigten typische Zeichen wie üblichin der Literatur beschrieben. Klinische Variabilität für diese Krankheit wurde bereits berichtet , und einige Autoren haben Faktoren wie Alter, Immunstatus, Expositionsweg, Virusdosis, Virulenz von Stämmen und Koinfektion mit diskutiertandere Infektionserreger als mögliche Ursachen . Dies erschwert die genaue Diagnose von CPV-2, wenn sich Tierärzte ausschließlich auf ihre klinische Untersuchung verlassen. In Bezug auf unsere Untersuchung, die ausschließlich auf diesem Verfahren basiert, haben 42,2% der Hunde eine falsch negative CPV-2-Diagnose.Durch die Krankenakten der Hunde in dieser Studie beobachteten wir, dass Veterinäre die Möglichkeit einer Infektion ausschlossen, hauptsächlich weil die Hunde nicht die in der Literatur beschriebenen klassischen klinischen Symptome zeigten, gegen CPV-2 geimpft worden waren und / oder erwachsen waren. Die meisten Hunde in unserer Studie zeigten jedoch atypische Anzeichen. Daher glauben wir, dass subklinische Infektionenvon CPV-2 sind häufiger, und Tierärzte, die entscheiden müssen, ob zusätzliche diagnostische Tests mit hoher Sensitivität und Spezifität verwendet werden sollen oder nicht, sollten diese Ergebnisse ernsthaft berücksichtigen.

In dieser Studie waren 40% der CVP-2-positiven Patienten zuvor immunisiert worden. Es ist bekannt, dass die PCR-Technik hochempfindlich ist und daher nachweisimpfende Viruspartikel im Kot von kürzlich geimpften Patienten; Studien zeigen, dass es möglich ist, falsch positive Ergebnisse von den Tagen 3 bis 10 nach der Impfung mit einem modifizierten CPV-Lebendimpfstoff zu erhalten . Folglich zur Durchführungdiese Studie, Patienten mit Impfanamnese an den letzten 15 Tagen wurden ausgeschlossen. Zusätzlich wurden Proben von geimpften Hunden, die positiv auf CPV-2 waren, sequenziert, und in allen untersuchten Fällen wurde die Genovariante CPV-2c identifiziert (Daten nicht angezeigt), was bedeutet, dass Hunde mit Feld-CPV-2c infiziert waren, da sie wussten, dass in Mexiko noch kein CPV-2c-Impfstoff verfügbar ist. Darüber hinaus berichteten Pedroza und Kollegen in Mexiko, dass die häufigste antigene Variante bei infizierten Hunden CPV-2c war .

Andererseits betrachten viele Tierärzte das Vorhandensein von Leukopenie als unterstützenden Faktor für die CPV-2-Diagnose. Allerdings beobachteten wir, dass nur 48.8% (22/45) der untersuchten Hunde zeigten während der Bewertung Leukopenie, was mit anderen Berichten übereinstimmt, denen zufolge etwa 50% der Hunde zum Zeitpunkt der Bewertung keine hämatologischen Veränderungen aufwiesen . Daher ist ein CBC ein wertvolles Instrument, das Informationen über den Schweregrad der Erkrankung liefern, eine Prognose vorschlagen und das Ansprechen auf die Behandlung bestimmen kann. Leukopenie sollte jedoch nicht als diagnostisches Instrument für CPV-2 angesehen werden,da es keinen Nachweis für das Vorhandensein von Viren liefert.

Verschiedene Techniken der viralen Identifizierung werden für die endgültige Bestätigung der Infektion durch CPV-2 verwendet, zum Beispiel Schnelltests basierend auf Immunochromatographiesind weit verbreitet von Klinikern verwendet, weil das Verfahren einfach, schnell und zugänglich ist. Darüber hinaus erfordert es keine Probenvorbereitung oder das Senden an ein spezialisiertes Labor zur Analyse. Die unterschiedliche Empfindlichkeit dieses Tests ist sein Nachteil; Mehrere Studien haben gezeigt, dass seine Empfindlichkeit zwischen 50 und 100% liegt , und in unserer Studie betrug die vergleichende Empfindlichkeit mit nPCR 66,6%. Einige Studien haben gezeigt, dass die geringe Empfindlichkeit der Technik auf die Notwendigkeit zurückzuführen ist, dass große Mengen an Viruspartikeln in den Stuhl von Hunden abgegeben werden müssen, um eine positive Diagnose zu erhalten . Die Verwendung dieser Technik muss überdacht werden, da eine höhere Wahrscheinlichkeit falsch negativer Ergebnisse erwartet wird. Um dies zu verhindern, müssen weitere Techniken mit höheren Empfindlichkeiten eingesetzt werden .

Mehrere Studien haben die hohe Empfindlichkeit von PCR-basierten Tests gezeigt; Derzeit gibt es mehrere Varianten desselben Verfahrens, die Empfindlichkeiten von 80 bis 100% bieten . In der vorliegenden Studie hatte die PCR eine Sensitivität von 80%, und es ist bemerkenswert zu erwähnen, dass die Patienten nur durch nPCR positiv auf Infektionen identifiziert wurden, während weder PCR- noch Immunochromatographietests sie identifizieren konnten.

In Bezug auf den Kappa-Wert haben wir die Ergebnisse der drei analysierten Methoden mit nPCR verglichen. Die schlechte Übereinstimmung zwischen klinischer Diagnose und NPCR wurde dennoch nachgewiesen; Zwischen konventioneller PCR und nPCR wurde eine mäßige Übereinstimmung beobachtet, die auf die Ähnlichkeit zwischen den beiden Tests zurückzuführen sein kann.

In Bezug auf die klinischen Symptome wurde bei allen viral infizierten Patienten entweder Erbrechen oder Durchfall beobachtet, während andere klinische Symptome nicht als für die Infektion relevant angesehen wurden; In Übereinstimmung mit den klinischen Symptomen und der Empfindlichkeit der verwendeten Techniken wurde kein Zusammenhang beobachtet. Zum Beispiel zeigte Fall Nr.26 nur Erbrechen als klinisches Zeichen, und es wurde als negativ für CPV-2 durch tierärztliche klinische Diagnose, jedoch Immunochromatographie-Test, PCR und NPCR-Tests waren positiv auf CPV-2. Darüber hinaus konnten die Fälle 41 und 42, in denen das klinische Hauptmerkmal Durchfall war, nur mit nPCR positiv auf CPV-2 diagnostiziert werden.

Unsere Daten zeigen, dass die am häufigsten verwendeten diagnostischen Tests in klinischen und diagnostischen Veterinärlabors zum Nachweis von CPV-2 hochspezifisch sind, aber siemangel Empfindlichkeit, die die genaue Diagnose von CPV-2 verhindert. In unserer Studie waren PCR und Immunochromatographie-Test nicht so empfindlich wie nPCR, was in früheren Untersuchungen bestätigt wurde, jedoch ist die Verwendung von nPCR als Diagnosetest in Tierkliniken noch nicht weit verbreitet, während es für Forschungszwecke weit verbreitet bleibt.

Andererseits wird die Real-Time-PCR, die ebenfalls hochsensibel ist, wegen ihrer hohen apparativen Kosten und der Anforderung eines hochspezialisierten Personals für ihre Handhabung nur selten eingesetzt. Technologische Fortschritte ermöglichten es jedoch, diese Techniken billiger und einfacher anzuwenden, was zu ihrer direkten Anwendung in Tierkliniken führen könnte, um die diagnostische Genauigkeit für CPV-2 zu verbessern.