Proteinreinigungbearbeiten
Polyhistidin-Tags werden häufig zur Affinitätsreinigung von Polyhistidin-markierten rekombinanten Proteinen verwendet, die in Escherichia coli und anderen prokaryotischen Expressionssystemen exprimiert werden. Bakterienzellen werden durch Zentrifugation geerntet und das resultierende Zellpellet entweder durch physikalische Mittel oder mittels Detergenzien und Enzymen wie Lysozym oder einer beliebigen Kombination davon lysiert. In diesem Stadium enthält Rohlysat das rekombinante Protein neben vielen anderen Proteinen, die vom bakteriellen Wirt stammen. Diese Mischung wird mit einem Affinitätsharz inkubiert, das gebundene zweiwertige Nickel- oder Koballionen enthält, die in verschiedenen Sorten kommerziell erhältlich sind. Nickel und Kobalt haben ähnliche Eigenschaften und sind benachbart zu 4 Übergangsmetallen (v. Eisentriade). Diese Harze sind im Allgemeinen Sepharose / Agarose funktionalisiert mit einem Chelator, wie Iminodiessigsäure (Ni-IDA) und Nitrilotriessigsäure (Ni-NTA) für Nickel und Carboxylmethylaspartat (Co-CMA) für Kobalt, die der Polyhistidin-Tag mit mikromolarer Affinität bindet. Ernst Hochuli et al. koppelte 1987 den NTA-Liganden und Nickel-Ionen an Agarosekügelchen. Das Harz wird dann mit Phosphatpuffer gewaschen, um Proteine zu entfernen, die nicht spezifisch mit dem Kobalt- oder Nickelion interagieren. Bei Ni-basierten Verfahren kann die Wascheffizienz durch Zugabe von 20 mM Imidazol verbessert werden (Proteine werden üblicherweise mit 150-300 mM Imidazol eluiert). Im Allgemeinen haben Harze auf Nickelbasis eine höhere Bindungskapazität, während Harze auf Kobaltbasis die höchste Reinheit bieten. Die Reinheit und Menge des Proteins kann durch SDS-PAGE und Western Blotting beurteilt werden.
Affinitätsreinigung unter Verwendung eines Polyhistidin-Tags führt normalerweise zu relativ reinem Protein, wenn das rekombinante Protein in prokaryotischen Organismen exprimiert wird. Abhängig von nachgelagerten Anwendungen, einschließlich der Reinigung von Proteinkomplexen zur Untersuchung von Proteinwechselwirkungen, kann die Reinigung von höheren Organismen wie Hefen oder anderen Eukaryoten eine Tandem-Affinitätsreinigung unter Verwendung von zwei Tags erfordern, um eine höhere Reinheit zu erzielen. Alternativ ergibt eine einstufige Reinigung unter Verwendung von immobilisierten Kobalionen anstelle von Nickelionen im Allgemeinen eine erhebliche Erhöhung der Reinheit und erfordert niedrigere Imidazolkonzentrationen für die Elution des his-markierten Proteins.
Polyhistidin-Tagging ist die Option der Wahl für die Reinigung rekombinanter Proteine unter denaturierenden Bedingungen, da seine Wirkungsweise nur von der Primärstruktur von Proteinen abhängt. Zum Beispiel, selbst wenn ein rekombinantes Protein zwangsweise in E exprimiert wird. coli produziert einen Einschlusskörper und kann nicht als lösliches Protein erhalten werden, es kann mit Denaturierung mit Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid gereinigt werden. Bei einem hohen pH-Wert bindet Histidin an Nickel oder Kobalt, aber bei einem niedrigen pH-Wert (~ 6 für Kobalt und ~ 4 für Nickel) wird Histidin protoniert und vom Metallion abgetrennt. Vergleichen Sie dies mit der Antikörperreinigung und der GST-Reinigung, deren Voraussetzung die richtige (native) Faltung der beteiligten Proteine ist. Andererseits wird gesagt, dass das His-Tag dazu neigt, mehr zu aggregieren und zu unlöslich zu machen als andere Affinitäts-Tags.
Polyhistidin-Tag-Säulen enthalten mehrere bekannte Proteine als Verunreinigungen. Eine davon ist die Peptidyl-Prolyl-Isomerase vom FKBP-Typ, die um 25 KDA (SlyD) auftritt. Verunreinigungen werden im Allgemeinen unter Verwendung einer sekundären chromatographischen Technik oder durch Expression des rekombinanten Proteins in einem SlyD-defizienten E. coli-Stamm eliminiert. Alternativ haben Harze auf Kobaltbasis im Vergleich zu Harzen auf Nickelbasis eine geringere Affinität zu SlyD aus E. coli, aber in mehreren Fällen ist es mäßig hilfreich.
Trennung von einem von zwei Polyhistidin-Tagsbearbeiten
Proteine mit unterschiedlicher Anzahl von Polyhistidin-Tags eluieren unterschiedlich aus nickelaffinem Harz. Für Proteine mit einem einzigen Hexahistidin-Tag ermöglicht 75 mM Imidazol die Elution aus Ni-NTA, während für Proteine mit zwei Hexahistidin-Tags 100 mM Imidazol zur Elution erforderlich sind. Diese schrittweise Elution kann verwendet werden, um spezifische Proteinanordnungen aus einer Mischung zu isolieren, wie definierte Heteromultimere (z. B. ein AB-Heterodimer aus einer Mischung, die AA- und BB-Homodimere enthält, wenn nur die Untereinheit B einen Polyhistidin-Tag aufweist). Ein solcher Ansatz wurde bei der Isolierung von monovalentem Streptavidin verwendet.
Bindungsassaysedit
Polyhistidin-Tagging kann verwendet werden, um Protein-Protein-Interaktionen auf die gleiche Weise wie ein Pull-Down-Assay nachzuweisen. Diese Technik wird jedoch im Allgemeinen als weniger empfindlich angesehen und auch durch einige der kniffligeren Aspekte dieser Technik eingeschränkt. Zum Beispiel können reduzierende Bedingungen nicht verwendet werden, EDTA und viele Arten von Detergenzien können nicht verwendet werden. Jüngste Fortschritte in der dualen Polarisationsinterferometrie sind EDTA und einer breiteren Verwendung von Reagenzien zugänglich, und die Verwendung solcher ortsspezifischen Tags vereinfacht die direkte Messung der damit verbundenen Konformationsänderung erheblich.
Fluoreszierende Tagsbearbeiten
Hexahistadine CyDye Tags wurden ebenfalls entwickelt. Diese verwenden eine kovalente Nickelkoordination mit EDTA-Gruppen, die an Fluorophore gebunden sind, um Farbstoffe zu erzeugen, die an das Polyhistidin-Tag binden. Es hat sich gezeigt, dass diese Technik bei der Verfolgung von Proteinmigration und -handel wirksam ist. Es gab auch neuere Entdeckungen, die zeigen, dass diese Technik wirksam sein kann, um die Entfernung über fluoreszierende Resonanzenergieübertragung zu messen.
Ein Polyfluorohistidin-Tag wurde für die Verwendung in In-vitro-Translationssystemen berichtet. In diesem System wird ein erweiterter genetischer Code verwendet, in dem Histidin durch 4-Fluorhistidin ersetzt wird. Das fluorierte Analogon wird über die entspannte Substratspezifität der Histidin-tRNA-Ligase in Peptide eingebaut und senkt die Gesamt-pKa des Tags. Dies ermöglicht die selektive Anreicherung von Polyfluorhistidin-markierten Peptiden in Gegenwart komplexer Mischungen traditioneller Polyhistidin-Tags durch Veränderung des pH-Werts der Waschpuffer.
