Flemming studierte Medizin an der Universität Prag und schloss sein Studium 1868 ab. Danach diente er 1870-71 als Militärarzt im Deutsch-Französischen Krieg. Von 1873 bis 1876 arbeitete er als Lehrer an der Universität Prag. 1876 nahm er eine Stelle als Professor für Anatomie an der Universität Kiel an. Er wurde Direktor des Anatomischen Instituts und blieb dort bis zu seinem Tod.
Unter Verwendung von Anilinfarbstoffen konnte er eine Struktur finden, die basophile Farbstoffe stark absorbierte, die er Chromatin nannte. Er stellte fest, dass Chromatin mit fadenförmigen Strukturen im Zellkern korrelierte – den Chromosomen (dh farbigen Körpern), die später vom deutschen Anatomen Wilhelm von Waldeyer-Hartz (1841-1923) so benannt wurden. Der belgische Wissenschaftler Edouard Van Beneden (1846-1910) hatte sie ebenfalls unabhängig beobachtet.
Flemming untersuchte den Prozess der Zellteilung und die Verteilung der Chromosomen auf die Tochterkerne, einen Prozess, den er Mitose vom griechischen Wort für Faden nannte. Er sah jedoch nicht die Spaltung in identische Hälften, die Tochterchromatiden. Er untersuchte die Mitose sowohl in vivo als auch in gefärbten Präparaten und verwendete als Quelle für biologisches Material die Flossen und Kiemen von Salamandern. Diese Ergebnisse wurden erstmals 1878 und 1882 in dem wegweisenden Buch Zellsubstanz, Kern und Zelltheilung (1882; Zellsubstanz, Zellkern und Zellteilung) veröffentlicht. Auf der Grundlage seiner Entdeckungen vermutete Flemming zum ersten Mal, dass alle Zellkerne von einem anderen Vorgängerkern stammten (er prägte den Ausdruck omnis nucleus e nucleo nach Virchows omnis cellula e cellula). Der ukrainische Biologe Petro Peremazhko (1833-1893) entdeckte 1878 die Mitose am Triturusschwanz.
Polytenchromosomen in einer Chironimus-Speicheldrüsenzelle, eine von über 100 Zeichnungen aus Flemmings Buch Zellsubstanz, Kern und Zelltheilung, 1885
Abbildungen von Zellen mit Chromosomen und Mitose, aus dem Buch Zellsubstanz, Kern und Zelltheilung, 1882
Flemming ist auch für seine Philanthropie bekannt. Er fütterte wöchentlich Obdachlose und spendete jedes Jahr 20% seines Gehalts an Obdachlosenheime. Er unterrichtete vor allem kleine Kinder, die zu arm waren, um zur Schule zu gehen, über Mathematik und Naturwissenschaften.
Flemming war sich der Arbeit von Gregor Mendel (1822-84) über Vererbung nicht bewusst und stellte daher keinen Zusammenhang zwischen seinen Beobachtungen und der genetischen Vererbung her. Zwei Jahrzehnte vergingen, bis die Bedeutung von Flemmings Werk mit der Wiederentdeckung von Mendels Regeln wirklich erkannt wurde. Der Science Channel nannte Flemmings Entdeckung von Mitose und Chromosomen als eine der 100 wichtigsten wissenschaftlichen Entdeckungen aller Zeiten und eine der 10 wichtigsten Entdeckungen in der Zellbiologie.
Flemmings Name wird mit einer Medaille der Deutschen Gesellschaft für Zellbiologie geehrt.
