Comparación entre la Descalcificación Convencional y un Método Asistido por Microondas en Tejido Óseo Afectado por Micetoma

Resumen

El micetoma es una enfermedad granulomatosa de los tejidos y huesos subcutáneos de por vida. La histopatología es un método indicativo fundamentado basado en la suposición de un diagnóstico definitivo de micetoma. Requiere un procesamiento eficiente de tejidos, incluida la descalcificación ósea. El proceso de descalcificación debe garantizar la eliminación completa del calcio y también una conservación adecuada de la capacidad de tinción de tejidos y microorganismos. Objetivo. Comparar el método convencional utilizado en la descalcificación con el método de microondas utilizando diferentes soluciones de descalcificación. Se evaluaron diferentes características, incluida la velocidad de descalcificación y la preservación morfológica y fúngica en el tejido óseo afectado por micetoma. Materiales y Métodos. Se emplearon tres soluciones de descalcificación para eliminar el calcio de 50 muestras de tejido óseo afectadas por micetoma, incluyendo EDTA tamponado neutro al 10% (pH 7,4), ácido nítrico al 5% y ácido clorhídrico al 5%. Se utilizaron métodos convencionales y de microondas. Se emplearon tinción de hematoxilina-eosina (HE), tinción de Gridley y tinción de hexamina y plata de Grocott para evaluar la morfología ósea y de hongos. Resultado. El tiempo de descalcificación del método convencional comparado con el método de microondas con EDTA al 10% (pH 7,4) tomó 120 horas y 29 horas, mientras que el ácido clorhídrico al 5% y el ácido nítrico al 5% tomaron 8 horas y 3 horas, por separado. Además, EDTA al 10% es el mejor agente descalcificador para manchas y hongos. se pueden utilizar 5% de ácido clorhídrico y 5% de ácido nítrico para la tinción fúngica. Conclusion. El presente estudio investigó los efectos de diferentes agentes descalcificadores, así como dos procedimientos de descalcificación sobre la preservación de la estructura ósea y la tinción fúngica, lo que ayudará a desarrollar protocolos adecuados para el análisis del tejido óseo afectado por infección por micetoma.

1. Introducción

El micetoma es una enfermedad epidémica granulomatosa y deletérea de por vida de la piel y los tejidos subcutáneos que puede progresar a estructuras más profundas como músculos y huesos y llevar a una destrucción extensa, principalmente de los pies, que requiere escisiones quirúrgicas locales amplias o amputación de extremidades . El micetoma se define por el triunvirato de expansión, senos nasales agotadores y la existencia de granos coloniales en los exudados inflamatorios . La infección se clasifica como eumicetoma (infección fúngica) o actinomicetoma (infección bacteriana) . Es en general una condición de regiones tropicales y semitropicales, notablemente Sudán . Los granos de cultivo Madurella mycetomatis son enormes, de 0,5 a 3 mm, y aparecen redondeados, ovalados o trilobulados. Consisten en hifas entrecruzadas incrustadas en cemento intersticial parduzco, que consisten en pigmento pardo-negro similar a la melanina . La histopatología es un método indicativo rápido, así como un proceso ventajoso en el supuesto de un diagnóstico definitivo de enfermedad por micetoma e incluye un informe que describe la presentación morfológica de los agentes causantes. El agente causal aún podría aislarse del tejido óseo involucrado . La descalcificación es un paso fundamental que se logra comúnmente para el examen histopatológico de los huesos . Los minerales en los huesos consisten en calcio y fósforo, y las sales insolubles comprenden más del sesenta por ciento del tejido óseo . Estos minerales proporcionan dureza ósea y son la causa de dificultades durante el corte de tejido con microtomos rotativos . Dichos tejidos deben tratarse para extraer fosfato de calcio mediante un procedimiento conocido como descalcificación, haciendo que el tejido sea lo suficientemente delicado para ser cortado por el microtomo. La descalcificación se logra mediante ácidos que forman sales de calcio solubles o agentes quelantes que se unen a los iones de calcio. Los métodos de descalcificación convencionales actuales se caracterizan por procesos laboriosos y la falla persistente de la reacción de tinción de los tejidos . En el método convencional de descalcificación, los tejidos óseos se colocan en un líquido descalcificador a temperatura ambiente con cambios de la solución a intervalos regulares hasta que se alcanza el punto final. La descalcificación por microondas es una técnica innovadora en comparación con el método convencional . En este proceso, los tejidos sólidos se colocan en la solución descalcificadora en un horno de microondas para duraciones periódicas con cambios habituales de los fluidos descalcificadores hasta que se alcanza el punto final. La radiación de microondas se ha llevado a cabo para acelerar el procedimiento de descalcificación aproximadamente de días a horas . El objetivo del presente estudio fue comparar el método convencional utilizado en descalcificación con el método de microondas modificado utilizando diferentes soluciones de descalcificación. Se probaron diferentes características, incluida la velocidad de descalcificación y la preservación morfológica y fúngica en tejido óseo afectado por la infección por Madurella mycetomatis.

2. Materiales y Métodos

Este es un estudio descriptivo experimental cuyo objetivo fue comparar el procedimiento de descalcificación convencional con la descalcificación mejorada por microondas con respecto a la morfología de los tejidos afectados por la infección por micetoma utilizando hematoxilina y eosina, tinciones de hexamina de Gridley y Grocott para la identificación completa de los organismos causales de Madurella mycetomatis. Este estudio se realizó en el Centro de Investigación de Micetomas del Hospital Universitario Soba y en la Facultad de Ciencias de Laboratorio Médico de la Universidad de Al Neelain. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes. Se recogieron cincuenta miembros amputados afectados por micetoma. Las biopsias óseas se cortaron con una sierra adecuada en trozos de 5 mm de espesor y luego se fijaron en solución salina formal al 10% durante 48 horas. Se lavaron con agua corriente del grifo durante 30 minutos para quitar el fijador.

2.1. Procedimiento convencional de descalcificación

Se sumergieron tres piezas de secciones de biopsias óseas de 5 mm de espesor en tres vasos de precipitados Pyrex de 250 ml, cada uno con 100 ml de ácido clorhídrico acuoso (HCl) al 5%, ácido nítrico acuoso (HNO3) al 5% y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) al 10%, colocados a temperatura ambiente (28°C de media), véase el Cuadro 1. El punto final de descalcificación se verificó utilizando el método de oxalato de calcio para los dos descalcificadores ácidos (5% HNO3 y 5% HCl) después de un intervalo de dos horas de la siguiente manera: se tomaron 5 ml del líquido descalcificador usado y se colocaron en un tubo de ensayo, luego se agregó papel de tornasol y se agregó hidróxido de amoníaco gota a gota hasta que el papel de tornasol cambiara, lo que indica que el líquido descalcificador de pH alcalino era transparente. se agregaron 5 ml de solución de oxalato de amonio saturado cuando la solución descalcificadora se volvió turbia, lo que indica la presencia de calcio en el tejido óseo, de modo que la solución descalcificadora se reemplazó por una solución nueva, y el proceso se repitió cada 30 minutos hasta completar el proceso de descalcificación. Para EDTA, se utilizó una prueba física de descalcificador en la que se consideró que el proceso de descalcificación había terminado cuando el hueso se atravesaba fácilmente con una aguja. El promedio total de tiempos descalcificados fue de 7 horas y 30 minutos, 8 horas y 120 horas para ácido nítrico al 5%, HCl al 5% y EDTA al 10%, respectivamente.

2.2. Procedimiento del horno de microondas

Se utilizó un horno de microondas casero (Microondas Midea 20L, 700W, Digital, EM720CFF) con una placa giratoria inamovible. Se precalentó un vaso de precipitados de vidrio que contenía 100 ml de agua destilada durante 5 segundos para calentar el magnetrón. Se sustituyó por 100 ml de agua destilada fresca e irradiada para mantener la temperatura en torno a los 41-43°C. Esto llevó 15 segundos. El vaso de precipitados de vidrio se asignó en varios puntos del horno mientras se irradia para resolver la mejor ubicación de la muestra durante la descalcificación por microondas, ya que el horno de microondas utilizado tenía un tiempo constante, pero no una temperatura constante. Se sumergieron tres piezas de secciones de biopsias óseas de 5 mm de espesor en vasos de precipitados Pyrex de 250 ml que contenían 100 ml de ácido clorhídrico acuoso (HCl) al 5%, ácido nítrico acuoso (HNO3) al 5% y EDTA al 10%. Luego, se transfirieron al horno de microondas, y las muestras se irradiaron durante diez ciclos de diez segundos cada uno (a intervalos de 15 minutos) por un tiempo total de 2-4 horas para descalcificadores ácidos (5% HNO3 y 5% HCl). La temperatura de la solución descalcificadora se mantuvo alrededor de 41-43°C. Se verificaron la solución descalcificadora y el punto final de descalcificación, y la solución descalcificadora se cambió repetidamente hasta completar la descalcificación. El punto final de descalcificación se verificó mediante oxalato de calcio y pruebas físicas como se mencionó anteriormente. Los tiempos promedio de descalcificación total fueron de 3 horas y 45 minutos, 5 horas y 30 minutos y 29 horas y 4 minutos para ácido nítrico al 5%, HCl al 5% y EDTA al 10%, respectivamente. Después de la descalcificación completa, los tejidos se lavaron con agua destilada y se transfirieron a una solución de amoníaco al 0,3% durante 5 minutos para neutralizar el ácido utilizado.

2.3. Procesamiento y tinción tisular

Las muestras se sometieron a procesamiento tisular automático utilizando los siguientes protocolos: las biopsias óseas se colocaron en solución salina formal al 10% durante una hora. Luego, alcohol al 50% una hora, alcohol al 70% una hora, alcohol al 90% una hora, seguido de alcohol al 100% tres cambios cada dos horas, xileno dos cambios, cada uno durante una hora y media, finalmente cera de parafina dos cambios cada uno durante dos horas. Los tejidos se incrustaron en bloques de parafina y se seccionaron a un grosor de 5-6 µm utilizando un microtomo rotativo. Las secciones se tiñeron con hematoxilina de Mayer, según lo descrito por Mayer en 1903, y la contra-tintura en cada una era de eosina al 1% (HE) . La tinción de Gridley se utilizó para la demostración de hongos, como describió Gridley en 1953); después de la desparafinización y rehidratación, se colocaron secciones de tejido en ácido crómico al 2% durante 30 minutos. Luego se lavaron bien con agua del grifo, se enjuagaron con agua destilada y luego se colocaron en el reactivo de Schiff durante 20 minutos. Luego se lavaron en agua corriente del grifo durante 10 minutos y se enjuagaron con etanol al 70% y luego con etanol al 95%. Se teñían con Metanil amarillo durante un minuto y se enjuagaban bien con agua destilada. Luego, se deshidrataron en xileno y se montaron en distireno, un plastificante y xileno (DPX). Luego, las secciones se examinaron bajo un microscopio . Además, se utilizó el método de hexamina-plata de Grocott para hongos descrito por Grocott en 1955, en el que las secciones se oxidaron con ácido crómico acuoso al 4% durante una hora, se lavaron en agua durante unos segundos, se trataron con metabisulfito de sodio al 1% durante un minuto, se lavaron en agua corriente del grifo durante 3 minutos, se enjuagaron a fondo en agua destilada, se colocaron en una solución de plata de trabajo precalentada en un baño de agua a 60°C durante 20 minutos, se enjuagaron bien en agua destilada, se lavaron con agua corriente del grifo durante 5 minutos, se 15 segundos, deshidratado y limpiado en xileno y montado en DPX, y finalmente examinado bajo un microscopio.

2.4. Evaluación de los resultados

Secciones fueron evaluadas por un histopatólogo experto. La calidad del procedimiento de descalcificación y el resultado de la tinción también se evaluaron y evaluaron por la regla empírica, y la calidad de la descalcificación se evaluó por los siguientes criterios: el tiempo de descalcificación, la preservación morfológica de la morfología de los tejidos y los hongos Madurella mycetomatis por HE; la tinción de metenamina y plata de Gridley y Grocott se calificó de 1 a 4 (1: pobre, 2: justo, 3: bueno y 4: excelente) .

2.5. Análisis estadístico

El análisis de los datos se realizó con el programa SPSS. Se utilizó ANOVA unidireccional para probar el efecto de las tres soluciones descalcificadoras en el análisis cuantitativo de la calidad de la sección y la preservación de los hongos. La prueba de Kruskal–Wallis se realizó para determinar si había una diferencia significativa entre las soluciones probadas para cada uno de los parámetros evaluados junto con los dos experimentos. Las diferencias con se interpretaron como estadísticamente significativas.

3. Resultados

Se incluyeron en el estudio cincuenta casos de Madurella mycetomatis con grano negro. Los pies fueron la región anatómica más afectada en 48 casos (96%) y dos casos (4,0%) en la mano. Con respecto al tiempo de descalcificación en diferentes experimentos, entre las tres soluciones probadas, la descalcificación con EDTA al 10% (pH 7,4) tomó el tiempo más largo para el método convencional (hasta 120 horas en comparación con 29 horas con el microondas), y el uso de una solución descalcificadora ácida tomó el tiempo más corto, que osciló entre 8 horas y 3 horas para diferentes métodos de descalcificación. La calidad de la morfología tisular de los diferentes tipos de solución descalcificadora utilizando el método de descalcificación por microondas en comparación con el método convencional con tinción de hematoxilina y eosina de Mayer con respecto a la apariencia nuclear y citoplasmática obtuvo resultados variables. Además, el hueso descalcificado con EDTA al 10% parecía tener un resultado significativamente superior (valor de P utilizando la prueba de chi cuadrado: 0,023) en comparación con el HNO3 al 5% y el HCl al 5%. El informe de tinción excelente fue de 43 (86%) versus 32 (64%), 42 (84%) frente a 18 (36%) y 33 (66%) frente a 1 (2%), respectivamente. Se utilizó el método de tinción de metenamina-plata de Grocott para la demostración del agente causal Madurella mycetomatis en relación con la morfología y el brillo de los hongos, y las secciones de tejido descalcificadas con EDTA al 10%, HNO3 al 5% y HCl al 5% utilizando métodos convencionales y de microondas mostraron una morfología fúngica significativamente mejor (valor de P utilizando la prueba de chi cuadrado: 0,001) de la siguiente manera: 33 (66%) versus 32 (64%), 33 (66%) frente a 39 (78%) y 22 (44%) frente a 31 (62%), respectivamente. La otra tinción fúngica utilizada para Madurella mycetomatis fue la tinción de Gridley con respecto a la morfología fúngica y la calidad de tinción de los huesos descalcificados con EDTA al 10%, HNO3 al 5% y HCl al 5% utilizando los métodos convencionales y de microondas, que mostraron resultados significativamente mejores (valor de P utilizando la prueba de chi cuadrado: 0,003) de la siguiente manera: 43 (86%) versus 41 (82%), 32 (64%) frente a 34 (68%) y 23 (46%) frente a 35 (70%), respectivamente. Estos resultados se resumen en la Tabla 2. La Figura 1 muestra los resultados de la tinción utilizando diferentes agentes descalcificadores y condiciones.

Figura 1

Demostración de la tinción de los resultados utilizando diferentes descalcificación de los agentes y condiciones.

4. Discusión

La identificación histopatológica del agente causal de Madurella mycetomatis está bien establecida, ya que es el procedimiento estándar de oro; sin embargo, el tejido duro y el hueso requieren descalcificación especial para preservar la estructura del tejido y la morfología del agente causal. Los agentes causales se pueden identificar utilizando hematoxilina y eosina (HE) y tinciones especiales para hongos, por lo que el hueso requiere un protocolo estándar de descalcificación que preserve el tejido, la morfología del agente causal y la capacidad de tinción. La descalcificación ósea es una técnica tediosa. Requiere semanas, y la conservación de la configuración del tejido depende de la excelencia y la velocidad del procedimiento de descalcificación. Se realizó un nuevo proceso con un horno de microondas para acelerar el proceso de descalcificación . La selección del agente descalcificante y de la manera está determinada básicamente por la seriedad del método , y los posibles usos de la energía de microondas en técnicas histológicas fueron documentados por primera vez por Mayers en 1970. Este sistema de método de emisión no ionizante se cree que acelera el proceso de descalcificación . La cinética molecular entonces causa la producción de cambio de energía, que dura hasta que la radiación se detiene . En este estudio, los tiempos de descalcificación reportados para la descalcificación mejorada por microondas y el procedimiento de descalcificación convencional fueron de 29 y 120 horas con EDTA al 10% (pH 7,4), tres y siete horas con ácido nítrico al 5% y cinco y ocho horas con HCl al 5%, respectivamente. Está claro que el método de descalcificación por microondas para tejido óseo afectado con infección por micetoma fue significativamente más rápido que el método convencional. Además, el ácido nítrico al 5% tenía una capacidad de descalcificación más rápida, seguido de ácido clorhídrico al 5% y luego EDTA (pH 7,4) para ambos métodos. Pitol et al. utiliza un hogar microondas para la eliminación de calcio de la rata hueso del 8,5% EDTA solución y muestra una disminución del periodo de prueba de 45 días en el proceso convencional a 48 h en el microondas asistida proceso. En este trabajo, la solución de EDTA al 10% tomó 120 horas en el método convencional y 29 horas usando microondas para lograr la descalcificación completa del tejido óseo afectado con infección por micetoma. La concentración de EDTA en nuestro experimento fue mayor que la de Pitol et al.’s estudio. Además de las diferencias en tamaño, grosor y tipos de hueso, estas pueden ser posibles explicaciones para los aumentos en el tiempo de descalcificación en Pitol et al.estudio que se redujeron en nuestro entorno. Además, la descalcificación del hueso afectado con infección por micetoma con el método convencional con ácido nítrico al 5% tardó siete horas, mientras que el método del horno de microondas tardó tres horas. Balaton y Loget lograron resultados comparables . Además, en esta investigación, los tiempos de descalcificación se redujeron con respecto a otros estudios. Los tiempos de descalcificación reportados para métodos convencionales y de microondas oscilaron entre un día y cuatro horas a 5 días y se consideran bajos en comparación con otros estudios en hueso de roedor, que han reportado tiempos entre 2 y 7 días con soluciones descalcificadoras ácidas y EDTA al 10% (pH 7,4), respectivamente . Shibata y su grupo informaron tiempos de descalcificación casi similares que variaron de 1 a 7 días con 10% de HCl, 10% de ácido nítrico y 10% de EDTA. Sin embargo, utilizaron descalcificadores ácidos con concentraciones más altas . Uma et al. se evaluaron los efectos de cuatro fluidos descalcificadores diferentes utilizando descalcificación por microondas en el hueso de rata y se informó de 1 a 1,5 días para ácido nítrico al 5% y ácido clorhídrico al 7%/EDTA al 2%. Sin embargo, el EDTA al 10% tardó de 14 a 26 días según el tipo de hueso . En estos estudios, el tipo de hueso, la naturaleza y el tamaño variaron y diferieron de los analizados aquí. El procedimiento de descalcificación fue una razón clave para la superioridad de la sección de tejido y la precisión de la tinción. Philipp et al. (2019) describieron que el método de descalcificación causa cambios morfológicos significativos que alteran la estructura de la proteína y afectan la capacidad de tinción del tejido . En nuestro estudio, el hueso se trató con ácido nítrico al 5% con el método manual de rutina, y hubo hinchazón en los tejidos blandos y pérdida de manchas nucleares y fúngicas en comparación con la descalcificación asistida por microondas. Los agentes descalcificantes ácidos suelen alterar la constancia de los huesos y los tejidos blandos. Estos efectos especiales en ácido nítrico al 5% se deben al período tomado y a la acidez de la solución. Por lo tanto, una descalcificación más rápida causará mayores lesiones y mayores efectos en H&E y tinción especial por hongos. Se pueden demostrar varios hongos con una sección histológica utilizando tinciones histoquímicas, como la tinción de plata metenamina de Grocott (GMS) y / o la tinción de Gridley (GS). Algunos hongos se pueden demostrar exactamente en el tejido con base en estructuras morfológicas; sin embargo, la eficacia del reconocimiento tendió a disminuir después de una fijación y descalcificación prolongadas utilizando métodos convencionales . En este estudio, la descalcificación asistida por microondas dio una tinción superior en comparación con el método convencional para morfología utilizando H&E y tinción especial por hongos, donde EDTA al 10% fue la solución que mejor conservó las estructuras de los tejidos y la capacidad de tinción por hongos a pesar de tomar mucho tiempo para la descalcificación.

5. Conclusiones y Recomendaciones

La descalcificación reforzada por el uso de un horno de microondas es una nueva técnica de descalcificación. Esta técnica se investigó en tejido óseo afectado con infección por Madurella mycetomatis utilizando EDTA al 10%, ácido nítrico al 5% y ácido clorhídrico al 5% como fluidos descalcificantes. Esto se comparó con la descalcificación convencional a temperatura ambiente para determinar la velocidad de descalcificación y la morfología tisular utilizando la tinción de hematoxilina y eosina de Mayer para la estructura ósea y las tinciones de Grocott y Gridley para la morfología fúngica. Se obtuvieron mejores resultados en comparación con el método convencional, tanto en morfología celular como en esporas e hifas de hongos con disminución del brillo de los hongos a temperatura ambiente. Este hallazgo puede ayudar a desarrollar protocolos adecuados para el análisis del tejido óseo afectado por la infección por micetoma.

6. Limitaciones del presente estudio

Un tamaño muestral mayor habría dado resultados más concluyentes. Además, es probable que los tiempos de descalcificación sean diferentes si se utilizan diferentes pesos óseos y muestras de hueso que no sean manos, ya que el tiempo de descalcificación depende del tamaño y la densidad estructural del tejido duro. Por último, dado que hemos utilizado un horno de microondas doméstico, nuestros registros de temperatura pueden haber sido solo aproximados.

Disponibilidad de datos

Los conjuntos de datos generados durante el estudio actual están disponibles a petición razonable del autor correspondiente.

Aprobación Ética

Este estudio fue aprobado por el Comité de Revisión Institucional de la Facultad de Ciencias de Laboratorio Médico de la Universidad de Al Neelain.

Conflictos de intereses

El autor declara que no existen conflictos de intereses.

Agradecimientos

El autor desea expresar su sincero agradecimiento al personal del Centro de Investigación Mycetoma, Universidad de Jartum, Jartum, Sudán, y un agradecimiento especial a los profesores Ahmed Hassan Fahal y Ahmed Mohammed El Hassan, profesor emérito de patología, por su asistencia.

Materiales suplementarios

Los materiales y reactivos utilizados para apoyar los resultados de este estudio se incluyen en la información complementaria. (Materiales complementarios)