10.4.2 Trehalosa para criopreservación de células de mamíferos
La criopreservación se ha empleado comúnmente para la preservación de células durante períodos prolongados a temperaturas extremadamente bajas. Sin embargo, los cambios físicos que ocurren durante la congelación y descongelación pueden ser perjudiciales para la supervivencia y las funciones celulares. Por lo tanto, los crioprotectores deben añadirse a las células durante la criopreservación. El uso de trehalosa como crioprotector para las células surgió de la noción de que los compuestos de polihidroxi se requieren a ambos lados de la membrana celular para que las células se conserven durante períodos más largos . La trehalosa ha sido explorada por varios grupos como un protector para la criopreservación de varias células humanas.
Beattie et al. introdujo trehalosa junto con DMSO en las células pancreáticas de Langerhans usando transición de fase líquida termotrópica . La criopreservación con trehalosa resultó en una recuperación del 92% de los islotes adultos, en comparación con solo el 58% de recuperación con DMSO solo. Se encontró catorce veces más insulina en los injertos de islotes criopreservados con trehalosa que en aquellos sin trehalosa. La recuperación de los grupos celulares fetales de islotes (CCI) criopreservados con trehalosa fue del 94%, en comparación con solo el 42% para aquellos sin trehalosa. Cuando se trasplantó a ratones desnudos, se observó un aumento de 15 veces en el contenido de insulina de injertos de ICC criopreservados con trehalosa. Estos resultados indican que la adición de trehalosa como crioconservador conduce a tasas de supervivencia muy altas del tejido endocrino pancreático humano.
Tóner y compañeros de trabajo introdujeron bajas concentraciones de trealosa en células de mamíferos utilizando una versión genéticamente modificada de la proteína formadora de poros alfa-hemolisina, y descubrieron que la trealosa intracelular puede mejorar en gran medida la supervivencia de estas células durante la criopreservación . Las tasas de supervivencia post descongelación a largo plazo de fibroblastos de ratón criopreservados y queratinocitos humanos fueron del 80% y el 70%, respectivamente, a una concentración de trehalosa intracelular de 0,2 M. También se encontró que la trehalosa intracelular tiene un efecto beneficioso sobre la integridad de la membrana de las células de mamíferos secas, con una recuperación de más del 90% de la membrana plasmática intacta observada al secar y almacenar las células en condiciones leves durante varias semanas .
El efecto de la trehalosa sobre la criopreservación de hepatocitos humanos fue investigado por Katenz et al. . Las células hepáticas congeladas en medio de cultivo con DMSO al 10% y trehalosa de 0,2 M mostraron una mejora significativa en la viabilidad celular posterior al deshielo y en la eficiencia de recubrimiento en comparación con DMSO solo. La presencia de trehalosa durante la criopreservación también dio lugar a un aumento del nivel total de proteínas en las células adheridas, niveles más altos de secreción de albúmina y niveles más bajos de aspartato amino transferasa después de la descongelación.
Las células madre son herramientas importantes para la investigación de la hematopoyesis, el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas y sistemas modelo para ciertas enfermedades. A pesar de los avances en la criopreservación, la muerte celular posterior al deshielo sigue siendo un problema importante. Martinetti et al. trehalosa usada para criopreservar células madre hematopoyéticas puras y células progenitoras de sangre periférica para prevenir la pérdida de células que ocurre durante el curso normal de criopreservación . Se evaluó la expresión del marcador de tallo superficial CD34 y se encontró que 1 M de trehalosa proporcionaba una mejor crioprotección a las células CD34+ con mayor número y viabilidad celular en comparación con el método de congelación estándar que utiliza DMSO. Además, la criopreservación con trehalosa durante períodos más cortos y más largos retuvo la capacidad de las células CD34+ para diferenciarse en células megacariopoyéticas después de la descongelación. Estos resultados sugieren la capacidad de la trehalosa para retener la viabilidad y las funciones de las células madre cuando se usa como crioprotector.
El almacenamiento a largo plazo de glóbulos rojos y plaquetas manteniendo un alto grado de viabilidad tiene implicaciones importantes en la transfusión de sangre y la medicina clínica. Satpathy et al. se describió un método para cargar glóbulos rojos con trealosa de un medio extracelular utilizando desequilibrio osmótico y transición de fase fosfolípida que dio lugar a concentraciones de trealosa intracelular de 40 mm. Se encontró que la trehalosa ejerce protección osmótica de los glóbulos rojos durante períodos más largos. La liofilización de los glóbulos rojos cargados de trehalosa seguida de rehidratación dio como resultado una supervivencia del 55% con retención de su morfología. Las células supervivientes sintetizaron ATP y 2,3-difosfoglicerato (DPG) y tenían bajos niveles de metahemoglobina. La actividad de SOD y catalasa y la estructura secundaria de la hemoglobina en los glóbulos rojos liofilizados fueron muy similares a las de los glóbulos rojos frescos. Este estudio demostró que la carga de trehalosa era necesaria para la estabilización de la hemoglobina y proporcionó un paso importante hacia la criopreservación de glóbulos rojos.
El tiempo normal de almacenamiento de las plaquetas de la sangre humana en los bancos de sangre es de 5 días después de los cuales se desechan, lo que resulta en una escasez crónica de plaquetas necesarias para la transfusión. Como un esfuerzo hacia la criopreservación de plaquetas por períodos más largos, Wolkers et al. describió un método para introducir trehalosa en el citoplasma de las plaquetas de la sangre humana . Se encontró que la trehalosa era fácilmente absorbida por las plaquetas humanas a 37 ° C con una eficiencia de carga de más del 50%. La liofilización y la rehidratación de las plaquetas cargadas de trehalosa dieron como resultado una excelente recuperación de las plaquetas intactas con una tasa de supervivencia del 85%. Estas plaquetas respondieron de manera casi idéntica a las plaquetas frescas hacia agonistas como trombina, ADP, colágeno y ristocetina. Los microdominios de membrana y los componentes proteicos de las plaquetas cargadas de trehalosa se mantuvieron intactos después de la liofilización y la rehidratación.
El efecto protector de la trehalosa también se demostró en células epiteliales corneales desecadas. La preincubación de células epiteliales corneales cultivadas con trehalosa seguida de secado resultó en una reducción significativa del porcentaje de células muertas, en comparación con el medio de control . El efecto protector también se confirmó ex vivo en ojos porcinos enucleados, donde el tejido incubado con trehalosa era visiblemente más suave . Estos resultados indican la utilidad de la trehalosa en oftalmología y su posible aplicación como colirio para el síndrome del ojo seco.
El uso de trehalosa para la criopreservación de orgánulos ha sido demostrado por Yamaguchi et al., que usó trehalosa como crioprotector para las mitocondrias congeladas . Las mitocondrias congeladas en presencia de trehalosa exhibieron integridad de la membrana externa mitocondrial (MOM) y capacidad de respuesta a las proteínas de la familia Bcl-2 similares a las de las mitocondrias frescas. La ultraestructura, la síntesis de ATP, el potencial transmembrana, la inflamación inducida por el calcio y la importación y procesamiento de proteínas precursoras también se preservaron en presencia de trehalosa. Esto es diferente del tampón estándar de sacarosa y manitol que se usa para congelar mitocondrias que a menudo se filtran. Por lo tanto, la trehalosa fue capaz de retener la mayoría de las características biológicas de las mitocondrias y las mitocondrias congeladas con trehalosa se pueden usar para la investigación de la apoptosis y otras funciones mitocondriales que dependen de la integridad de la madre.
La trehalosa se ha utilizado para la preservación de órganos durante períodos prolongados. El grupo de la Ama desarrolló una «solución ET-Kyoto» para la preservación del pulmón canino durante >30 horas sin afectar el rendimiento de las células endoteliales y la vasculatura . La estabilización y preservación prolongadas de vacunas y anticuerpos también se han logrado utilizando trehalosa.
