El ensayo TUNEL se usa más comúnmente para detectar células que experimentan apoptosis, que es una forma de muerte celular programada. La apoptosis es un proceso biológico importante durante el desarrollo y para mantener la homeostasis tisular. La tinción TUNEL permite la visualización y cuantificación de células apoptóticas. Esto ayuda a los científicos a probar la eficacia de nuevos tratamientos para trastornos en los que la apoptosis se inhibe, como en el cáncer, o se mejora, como en la neurodegeneración.
Este video explicará cómo se puede usar el ensayo TUNEL para etiquetar las células que se someten a apoptosis, un protocolo paso a paso para realizar este método en secciones de tejido, y cómo los investigadores están aplicando esta técnica para comprender los mecanismos de muerte celular.
Antes de profundizar en el protocolo del ensayo TUNEL, discutamos los principios detrás de esta técnica.
Una de las muchas características distintivas de la apoptosis es la fragmentación del ADN. ¿Cómo ocurre la fragmentación del ADN? La apoptosis se lleva a cabo por enzimas llamadas caspasas presentes en el citosol. Su función principal es escindir las proteínas para desmantelar la célula. Además, las caspasas activan una enzima llamada DNasa activada por caspasa, o CAD, separándola de su inhibidor, el ICAD. La CAD activada es una endonucleasa que viaja al núcleo y escinde el ADN cromosómico.
La escisión del ADN en última instancia causa la acumulación de fragmentos de ADN con extremos cortados, y el ensayo TUNEL etiqueta fluorescentemente estos extremos cortados de ADN fragmentado, lo que permite a los científicos detectar la apoptosis. Pero, ¿cómo sucede esto? Para eso tienes que entender la reacción del TÚNEL. TUNEL significa etiquetado de extremo de nick dUTP mediado por desoxinucleotidil transferasa terminal. Los dos reactivos principales del TÚNEL son la desoxinucleotidil transferasa terminal, o TdT, y el trifosfato de desoxiuridina, o dUTP, que pueden etiquetarse fluorescentemente para facilitar la detección.
Para entender la reacción del TÚNEL, volvamos a las células apoptóticas con fragmentos de ADN. Estos fragmentos cortados tienen grupos hidroxilos libres de 3′. Una vez que se agregan los reactivos TUNEL a una muestra que contiene células apoptóticas, los dUTPs etiquetados fluorescentemente se unen a estos grupos hidroxilos de 3′ con la ayuda de la enzima catalizadora TdT. Las células teñidas mediante este procedimiento se denominan células TUNEL positivas, que luego se pueden visualizar mediante microscopía de fluorescencia.
Ahora que comprende los principios y conceptos básicos detrás del ensayo TUNEL, describamos un protocolo general para realizar esta técnica en secciones de tejido. Los pasos principales del ensayo de TÚNEL incluyen la fijación del tejido de interés, la permeabilización del tejido, la adición de reactivos de TÚNEL, la detención de la reacción de TÚNEL y, finalmente, el análisis.
En primer lugar, el tejido de interés debe fijarse para preservar las estructuras biológicas. La fijación funciona mediante la reticulación de proteínas dentro de las células. Para el ensayo de TÚNEL, los tejidos se pueden fijar añadiéndolos a una solución que contenga 4% de paraformaldehído durante 4-24 horas a 4°C. Después de la fijación, criosección del tejido en rodajas finas de 10 µm o menos.
El siguiente paso es la permeabilización, que permite que reactivos como la enzima TdT penetren en el núcleo celular. La permeabilización de las secciones de tejido se puede realizar agregando el tejido a la solución de proteinasa K durante 5-15 minutos a 37°C. Enjuague las secciones de tejido con solución salina tamponada con fosfato en un agitador orbital durante 15-30 minutos a temperatura ambiente.
Después de la permeabilización, la enzima TdT y los dUTPs marcados fluorescentemente se agregan a las secciones de tejido, junto con un tampón de etiquetado que contiene cobalto que actúa como cofactor para la reacción del TÚNEL. Juntos, la mezcla de reacción de TÚNEL y la sección de tejido se incuban durante 1-3 horas a 37°C, y se protegen de la luz para evitar que la fluorescencia se desvanezca.
Después de la incubación, se agrega tampón de parada a la sección de tejido para detener la reacción de TÚNEL, y después de una incubación corta, las secciones se lavan con solución salina tamponada con fosfato. Finalmente, las secciones de tejido teñidas con dUTP marcado fluorescentemente se visualizan mediante microscopía de fluorescencia y se evalúan para la localización de células TUNEL positivas dentro de un tejido dado. Se puede cuantificar la muerte celular simplemente contando el porcentaje de células TUNEL positivas en una sección de tejido dada.
Ahora que ha visto cómo realizar el ensayo TUNEL para detectar células apoptóticas, analicemos cómo se puede usar este ensayo para responder a las preguntas de los biólogos celulares.
La muerte celular ocurre como una parte normal del desarrollo para esculpir tejidos y estructuras, y para eliminar células innecesarias. Por lo tanto, los científicos interesados en este fenómeno estudian el efecto de la exposición prenatal a diferentes sustancias en la apoptosis durante el desarrollo. Aquí, los científicos estaban interesados en examinar el efecto de la exposición prenatal al alcohol en el desarrollo cerebral. Los resultados de la tinción de TÚNEL realizada en cerebros fetales revelaron un aumento de la apoptosis en los tejidos expuestos al alcohol antes de nacer, en comparación con los animales de control.
Los científicos también utilizan el ensayo TUNEL para investigar la apoptosis en respuesta a una infección bacteriana. En este experimento, los científicos desarrollaron un modelo de neumonía inyectando a ratones Pseudomonas aeruginosa, que induce inflamación pulmonar. Luego, se extirpó tejido pulmonar y se realizó tinción de TÚNEL para examinar la apoptosis en respuesta a la infección bacteriana. Los resultados muestran que la muerte celular apoptótica aumentó en ratones expuestos a la bacteria, en comparación con los animales de control.
Por último, la tinción de TUNEL se puede usar en muestras de tumores humanos para determinar la respuesta del tumor a los medicamentos. En este ejemplo, se extrajeron muestras de tumores de pacientes humanos y se cultivaron ex vivo. A continuación, se trataron con fármacos preclínicos y se evaluó la respuesta mediante el ensayo TUNEL. Los datos obtenidos muestran que el tratamiento con un fármaco que inhibe la proteína de choque térmico 90 aumenta significativamente la apoptosis en el tejido tumoral.
Acaba de ver el video de JoVE sobre el uso del ensayo TUNEL para detectar células que sufren apoptosis. Este video revisó los principios detrás de la tinción de TÚNEL y un protocolo paso a paso para realizar el ensayo de TÚNEL en secciones de tejido. También revisamos cómo se podría aplicar este método para comprender la muerte celular programada durante el desarrollo y la enfermedad. Como siempre, ¡gracias por mirar!
