G418

G418 (Geneticina, Invitrogen): Disolver en agua a 200 mg/ml, filtrar esterilizar y almacenar en alícuotas a 4 °C.

clonNAT (nourseotricina, Werner BioAgents, Jena, Alemania): Disolver en agua a 100 mg/ml, filtrar esterilizar y almacenar en alícuotas a 4 °C.

Canavanina (sal de sulfato de l-canavanina, Sigma, C-9758): Disolver en agua a 100 mg/ml, filtrar esterilizar y almacenar en alícuotas a 4 °C.

Tialisina (clorhidrato de S-(2-aminoetil)-l-cisteína, Sigma, A-2636): Dissolve in water at 100 mg/ml, filter sterilize, and store in aliquots at 4 °C.

Amino acids supplement powder mixture for synthetic media (complete): Contains 3 g adenine (Sigma), 2 g uracil (ICN), 2 g inositol, 0.2 g para-aminobenzoic acid (Acros Organics), 2 g alanine, 2 g arginine, 2 g asparagine, 2 g aspartic acid, 2 g cysteine, 2 g glutamic acid, 2 g glutamine, 2 g glycine, 2 g histidine, 2 g isoleucine, 10 g leucine, 2 g lysine, 2 g methionine, 2 g phenylalanine, 2 g proline, 2 g serine, 2 g threonine, 2 g tryptophan, 2 g tyrosine, and 2 g valine (Fisher). La mezcla de polvo de salida (DO) es una combinación de los ingredientes anteriores menos el suplemento apropiado. Se utilizan dos gramos de la mezcla de polvo de OD por litro de medio.

Suplemento de aminoácidos para medio de esporulación: Contiene 2 g de histidina, 10 g de leucina, 2 g de lisina, 2 g de uracilo; se utiliza 0,1 g de la mezcla de polvo de suplementos de aminoácidos por litro de medio de esporulación.

Glucosa (Dextrosa, Fisher): Prepare una solución al 40%, autoclave y guárdela a temperatura ambiente.

YEPD: Añadir 120 mg de adenina (Sigma), 10 g de extracto de levadura, 20 g de peptona y 20 g de bacto agar (BD Difco) a 950 ml de agua en un matraz de 2 litros. Después del autoclave, agregue 50 ml de solución de glucosa al 40%, mezcle bien, enfríe a ~ 65 °C y vierta las placas.

YEPD + G418: Enfriar el medio YEPD a ~ 65 ° C, añadir 1 ml de solución madre G418 (concentración final de 200 mg/l), mezclar bien y verter las placas.

YEPD + clonNAT: Enfriar el medio YEPD a ~ 65 ° C, añadir 1 ml de solución madre de clonNAT (concentración final de 100 mg/l), mezclar bien y verter las placas.

YEPD + G418 / clonNAT: Enfriar el medio YEPD a ~ 65 ° C, añadir 1 ml de soluciones madre de G418 (concentración final de 200 mg/l) y 1 ml de clonNAT (concentración final de 100 mg/l), mezclar bien y verter las placas.

Esporulación enriquecida: Añadir 10 g de acetato de potasio (Fisher), 1 g de extracto de levadura, 0,5 g de glucosa, 0,1 g de mezcla de polvo de suplemento de aminoácidos para la esporulación, 20 g de bacto agar a 1 l de agua en un matraz de 2 l. Después del autoclave, enfríe el medio a ~ 65 ° C, agregue 250 µl de solución madre G418 (concentración final de 50 mg/l), mezcle bien y vierta las placas.

(SD/MSG) − His/Arg/Lys + canavanina/tialisina/G418: Añadir 1,7 g de base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos o sulfato de amonio (BD Difco), 1 g de MSG (hidrato de sal sódica de ácido l-glutámico, Sigma), 2 g de mezcla de polvo de suplemento de aminoácidos (DO − His/Arg/Lys), 100 ml de agua en un matraz de 250 ml. Añadir 20 g de bacto agar a 850 ml de agua en un matraz de 2 litros. Autoclave por separado. Combine soluciones esterilizadas en autoclave, agregue 50 ml de glucosa al 40%, medio frío a ~ 65 ° C, agregue 0,5 ml de canavanina (50 mg/l), 0,5 ml de tialisina (50 mg/l) y 1 ml de soluciones madre G418 (200 mg / l), mezcle bien y vierta las placas. El sulfato de amonio impide la función de G418 y clonNAT. Por lo tanto, el medio sintético que contiene estos antibióticos se fabrica con ácido glutámico monosódico como fuente de nitrógeno (Cheng et al., 2000).

(SD/MSG) − His/Arg/Lys + canavanina/tialisina/clonNAT: Añadir 1,7 g de base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos o sulfato de amonio, 1 g de MSG, 2 g de mezcla de polvo de suplemento de aminoácidos (DO − His/Arg/Lys), 100 ml de agua en un matraz de 250 ml. Añadir 20 g de bacto agar a 850 ml de agua en un matraz de 2 litros. Autoclave por separado. Combine soluciones esterilizadas en autoclave, agregue 50 ml de glucosa al 40%, medio frío a ~ 65 ° C, agregue 0.5 ml de canavanina (50 mg/l), 0,5 ml de tialisina (50 mg/l) y 1 ml de soluciones madre de clonNAT (100 mg/l), mezcle bien y vierta las placas.

(SD/MSG) − His/Arg/Lys + canavanina/tialisina/G418/clonNAT: Añadir 1,7 g de base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos o sulfato de amonio, 1 g MSG, 2 g de mezcla de polvo de suplemento de aminoácidos (DO − His/Arg/Lys), 100 ml de agua en un matraz de 250 ml. Añadir 20 g de bacto agar a 850 ml de agua en un matraz de 2 litros. Autoclave por separado. Combinar soluciones esterilizadas en autoclave, añadir 50 ml de glucosa al 40%, medio frío a ~ 65 ° C, añadir 0,5 ml de canavanina (50 mg / l), 0.5 ml thialysine (50 mg/l), 1 ml de G418 (200 mg/l) y 1 ml clonNAT (100 mg/l) existencias las soluciones, mezcle bien y vierta placas.

(SD/MSG) Completo: Añadir 1,7 g de base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos o sulfato de amonio, 1 g de MSG, 2 g de mezcla en polvo de suplemento de aminoácidos (completa), 100 ml de agua en un matraz de 250 ml. Añadir 20 g de bacto agar a 850 ml de agua en un matraz de 2 litros. Autoclave por separado. Combine soluciones esterilizadas en autoclave, agregue 50 ml de glucosa al 40%, mezcle bien, enfríe el medio a ~ 65 °C y vierta las placas.

SD-His / Arg / Lys + canavanina / tialisina: Añadir 6.7 g de base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos (BD Difco), 2 g de mezcla de polvo de suplemento de aminoácidos (DO − His/Arg/Lys), 100 ml de agua en un matraz de 250 ml. Añadir 20 g de bacto agar a 850 ml de agua en un matraz de 2 litros. Autoclave por separado. Combine soluciones esterilizadas en autoclave, agregue 50 ml de glucosa al 40%, medio frío a ~ 65 ° C, agregue 0,5 ml de canavanina (50 mg/l) y 0,5 ml de tialisina (50 mg/l) soluciones madre, mezcle bien y vierta las placas. Este medio no contiene antibióticos como G418 o clonNAT y, por lo tanto, se utiliza sulfato de amonio como fuente de nitrógeno.

SD − Leu/Arg/Lys + canavanina/tialisina: Añadir 6,7 g de base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos, 2 g de mezcla de polvo de suplemento de aminoácidos (DO-Leu / Arg / Lys), 100 ml de agua en un matraz de 250 ml. Añadir 20 g de bacto agar a 850 ml de agua en un matraz de 2 litros. Autoclave por separado. Combine soluciones esterilizadas en autoclave, agregue 50 ml de glucosa al 40%, medio frío a ~ 65 ° C, agregue 0,5 ml de canavanina (50 mg/l) y 0,5 ml de tialisina (50 mg/l) soluciones madre, mezcle bien y vierta las placas.