Informes oncológicos

Introducción

Aunque recientemente se han introducido en la práctica clínica terapias novedosas para el tratamiento del cáncer avanzado de próstata, el cáncer de próstata siguió siendo el segundo cáncer más muerto en hombres en los Estados Unidos en 2014 (1). Se necesitan urgentemente nuevas dianas y estrategias terapéuticas para mejorar aún más los resultados clínicos de los pacientes con cáncer de próstata.

Una diana terapéutica potencial prometedora es la cinasa 5 dependiente de la ciclina (CDK5). CDK5 es una quinasa de serina / treonina estructuralmente similar a otras CDK (2). La CDK5 no parece tener una función principal en la regulación del ciclo celular (3,4). Se ha caracterizado bien por su papel dominante en el desarrollo del sistema nervioso central, incluidos los roles de migración, diferenciación y adhesión inneuronales (5,6). Posteriormente, We y otros demostraron que la CDK5 desempeña un papel importante en el desarrollo del cáncer y la metástasis (7-12). En células cancerosas proestatales, demostramos que CDK5 era crítico para la integridad esquelética, la migración e invasión celular, y el invivo, para la metástasis (7). En el cáncer pancreático, la CDK5 es intrínseca a la señalización de KRAS a través de la vía de transducción de señales RAL de importancia central, lo que proporciona un objetivo potencial «farmaceable» para los tumores de KRAS mutantes (8). En conjunto, estos estudios indican que la prohibición de CDK5, sola o en combinación con otros agentes, puede proporcionar una estrategia terapéutica eficaz para estos y otros tipos de cáncer.

En el presente estudio nos propusimos identificar agentes que serían particularmente eficaces en combinación con la exposición a CDK5 en células de cáncer de próstata. Por lo tanto, realizamos una pantalla de la Biblioteca de Medicamentos Johns Hopkins (JHDL). La JHDL es una colección de 3360 compuestos farmacéuticos que han completado con éxito pruebas de seguridad en seres humanos para una variedad de aplicaciones(13,14). Esta biblioteca se ha utilizado con éxito para la reutilización de compuestos para la terapia del cáncer,incluida la identificación de la digoxina como inhibidor de HIF1a (15) y el itraconazol como inhibidor de la angiogenia (16). Anteriormente, empleamos el JHDL para identificar el bromuro de cetronio y el irinotecán como compuestos con mayor actividad antitumoral contra el cáncer de próstata, que expresan bajos niveles del gen supresor de metástasis N-mycdownregulated gen 1 (NDRG1) (17).Aquí, realizamos un cribado de JHDL similar con células de cáncer de próstata que difieren en la actividad de CDK5. La tilorona se identificó como un compuesto con células cancerosas de próstata con deficiencia de inCDK5 de letalidad sintética in vitro.

Materiales y métodos

Cultivo celular

Las líneas celulares de cáncer de próstata PC3 se obtuvieron del CCAT. Estas células se derivan de una metástasis ósea de un paciente con cáncer de próstata de 62 años de edad. Los fibroblastos de próstata humanos, proporcionados por el Dr. J. Isaacs, se obtuvieron de una biopsia de próstata en un paciente con cáncer de próstata de 62 años de edad con una puntuación de Gleason de 4. Ambas líneas de células se cultivaron y mantuvieron en medios RPMI-1640 (Invitrogen)suplementados con suero bovino fetal al 10%. Las células se cultivaron en una incubadora humidificada a 37°C en una atmósfera de CO2 al 5%.

Creación de la línea celular PC3 CDK5dn

La pérdida de la función CDK5 se logró en células PC3 mediante transfección de una construcción dominante negativa que contenía una conmutación D144, amablemente proporcionada por el Dr. L. H. Tsai(Escuela de Medicina de Harvard) (18). El protocolo utilizado ha sido descrito previamente (7). En resumen, el constructo fue subclonado en un vector Tet bidireccional, pBI-EGFP(BD Biosciences), que tenía un gen de resistencia a la zeocina agregado para la selección (amablemente proporcionado por el Dr. K. Schuebel, Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins). El vector vacío pBI-EGFP o el vector PBI-EGFPCDK5dn se transfectó a células PC3 que contenían construcción promotora aTet-Off, pTTa (BD Biosciences).

Western blotting

Western blot se realizó como se describió anteriormente (19). Se cargaron diez microgramos de proteína en el gel. Los anticuerpos primarios se disolvieron en tampón bloqueante . Se utilizó una dilución de 1:1.000 para anti – CDK5 (Sigma-Aldrich); anti-vinculina (Milipora,norte del estado) se diluyó de 1:4.000. Los anticuerpos secundarios se diluyeron ata 1: 4.000 dilución. La normalización de la intensidad de la banda se llevó a cabo con la proteína vinculina del ama de llaves. Las manchas desarrolladas se escanearon utilizando un escáner Microtek.

Ensayo de cicatrización de heridas

Se realizaron ensayos de cicatrización de heridas con control confluentPC3 (que contenía el vector pBI-EGFP vacío) o células PC3 CDK5DN. Se utilizó un raspador con punta de goma para raspar un área de células. Se capturaron inmediatamente imágenes microscópicas de luz y se rasparon 24 hafters.

Selección de bibliotecas de moléculas pequeñas

La biblioteca JHDL se ha descrito anteriormente (13,14,17).El almacenamiento y el cribado de los compuestos de JHDL se llevaron a cabo como se había descrito anteriormente (17).Brevemente, las células de control PC3 y CDK5dn se sembraron en placas de 96 pocillos (1×103 células/pocillo) y se dejaron adherir durante la noche. A continuación, se añadieron 5 µl de fármacos, almacenados como soluciones madre de 200 µM de inDMSO/H2O, al medio RPMI completo, de modo que las células se trataron a una concentración final de 10 µM. Después de 48 h de tratamiento, se añadieron 20 µl de reactivo MTS del Ensayo de Proliferación Celular No Radiactiva CellTiter 96™ Aqueous a cada pozo durante 2-4 h a 37°C. Las placas se analizaron con el lector de placas aSoftMax Pro (Dispositivos moleculares). La proliferación de células tratadas se comparó con la proliferación de células PC3control o CDK5dn tratadas con DMSO (índice de proliferación). Los índices de proliferación de células PC3 CDK5dn se compararon con los índices de proliferación de células de control PC3. Se realizó un estudio PubMed para evaluar el uso clínico de posibles hits.

Ensayos de MTS

Se realizaron ensayos de MTS para medir el efecto antiproliferativo del tratamiento con tilorona. El clorhidrato de tiloronediato (Sigma-Aldrich) se almacenó como solución de stock de 10 mM en DMSO a -20°C. Mil celdas de PC3 fueron plateadas en placas de 96 pocillos que contenían medios RPMI completos de 100 µl. A una confluencia de alrededor del 50%, se administró dihidrocloruro de tilorona. Para los experimentos, el compuesto se diluyó en medios RPMI completos para obtener la concentración final deseada. Después del tratamiento de 72 h(tilorona en monoterapia), se añadió reactivo MTS y se determinó la absorción a 490 nm utilizando un lector de placas SoftMax Pro.Se calcularon índices de proliferación; como control se utilizaron células PC3 de control o CDK5DN no tratadas (en medios RPMI completos de 103 µl). Se realizaron pruebas t de Student para evaluar los valores p.

Ensayos clonogénicos

Se realizaron ensayos clonogénicos para evaluar la supervivencia a largo plazo después del tratamiento con tilorona. Las células cancerosas de próstata se colocaron en platos de 60 mm y se dejaron adherir. A una confluencia del 50-60%, las células se trataron con tilorona durante 72 h. Posteriormente, 1×103 células de cada plato se platearon en platos triplicados de 60 mm y se incubaron en medios RPMI completos durante 12 días.Las colonias se fijaron y teñieron con una solución que contenía 90% de metanol y 10% de solución de violeta cristal (2,3% de violeta cristal, 0,1% de oxalato de amonio y 20% de alcohol etílico; Sigma). Las colonias se escaneaban con un escáner de computadora (Microtek) y se contaban manualmente.Se realizaron pruebas t de Student para evaluar si las diferencias entre líneas celulares eran estadísticamente significativas.

Ensayo de crecimiento 3D

Se realizaron ensayos de crecimiento 3D utilizando el mismo protocolo descrito anteriormente (17). En resumen, se generaron esferoides mediante el cultivo de células PC3 durante 16 h como una gota colgante sobre una placa humidificada en una incubadora de CO2 en un medio RPMI completo que contiene 0,5% de metilcelulosa. Los esferoides se incrustaron en una matriz de colágeno (BD Biosciences), se trataron con tilorona y se tomaron imágenes con un microscopio Nikon Eclipse Ti (Nikon) el día del tratamiento y seis días después del inicio del tratamiento. Se midieron las áreas esferoides y totales (brotes spheroidplus) con ImageJ. Los aumentos de pliegue se calcularon dividiendo el esferoide/área total en el día 6 por el esferoide/área total en el día 0 para cada esferoide individual. Para cada línea de célula y punto de tiempo, se evitaron aumentos de plegado de cuatro esferoides. Los análisis estadísticos se realizaron mediante pruebas de estudiantes.

Resultados

Supresión de la actividad CDK5

Para la prueba de detección de células de cáncer de próstata PC3 se eligieron células de cáncer de próstata PC3 debido a su potencial altamente metastásico e independencia de los andrógenos, lo que se asemeja al cáncer de próstata resistente al castrato metastásico agresivo. La actividad de CDK5 fue inhibida por la transfección y selección de una mutación dominante negativa (CDK5144N). Estas células CDK5dn de PC3 tenían un nivel de proteína mayor de CDK5 total en comparación con las células control de PC3 (células PC3 transfectadas con un vector vacío) (Fig. 1A). El ensayo de curación anuda (8) confirmó que CDK5 estaba funcionalmente inactivo en estas células; a diferencia de las células de control PC3, las células PC3 CDK5dn no tenían la capacidad de invadir el área de superficie raspada (Fig.1B).

Pantalla de biblioteca para compuestos dirigidos a células PC3 en función de la actividad de CDK5

Se realizó un ensayo de detección de alto rendimiento para seleccionar compuestos dirigidos a células PC3 en función de la actividad de CDK5. Las células PC3control y CDK5dn se trataron con todos los compuestos de la JHDL a 10 µM durante 48 h. Para identificar impactos que apunten selectivamente a las células PC3 en función de la expresión de CDK5, seleccionamos todos los compuestos en los que la relación de índice de proliferación (CDK5dn/control) estaba por debajo de 0,5 o por encima de 1,5 (Fig. 2A).Además, los hits tenían que inhibir la proliferación celular de células PC3 en al menos un 10%, ya que estábamos específicamente interesados en compuestos que inhibían el crecimiento celular (línea horizontal y vertical en el gráfico). También seleccionamos todos los compuestos que inhibían la proliferación celular en las células C3 en un 70% (esquina inferior izquierda del gráfico), ya que estábamos interesados en identificar agentes antitumorales potenciales altamente efectivos. En total, se seleccionaron 41 visitas para su evaluación ulterior.

Se realizó una criba secundaria en la que se añadieron unidades seleccionadas de la criba primaria a 10 µM durante 48 h a células PC3control y CDK5dn por triplicado, para eliminar resultados de falsos positivos (Fig. 2B). Los valores de corte eran ligeramente menos estrictos que en la pantalla primaria; los compuestos se consideraban un acierto cuando la relación de los índices de proliferación(CDK5dn/control) era inferior a 0,7 o superior a 1,4. Esto resultó en la identificación de tres compuestos que se dirigen selectivamente a las células PC3 que expresan CDK5: rutilantin, lactato de etacridina y cloruro de cetalconio (Fig. 2C).Estos compuestos no se han utilizado como agentes antitumorales y su uso clínico potencial como agentes antitumorales intravenosos parece limitado (20-23). Otro compuesto, el análogo de tilorona 9536-DA, fue altamente eficaz en la inhibición de ambas líneas celulares isogénicas de PC3 (inhibición>70%), pero inhibió la proliferación de células de PC3CDK5dn de manera algo más efectiva (relación CDK5dn/control:0,687). La tilorona y sus análogos tienen actividad antiviral, actuando al menos en parte como inductores de interferón (24-26)y se ha demostrado preclínica y clínicamente que también tienen actividad antitumoral (27,28).

La tilorona se dirige selectivamente a las células PC3 con baja actividad CDK5

Continuamos nuestros experimentos con dihidrocloruro de dilorona recién disuelto. Después de 72 h de tratamiento con tilorona a diversas concentraciones, su CI50 se estableció en 8-12 µm en células PC3 CDK5dn y 15 µM en células de control PC3 en ensayos MTS(Fig. 3A). A 8 µM, la actividad de proliferación disminuyó en un 24 y un 47% en las células de control PC3 y CDK5DN, respectivamente (p=0,001). Para evaluar la toxicidad de las células prostáticas normales de tilorona, se realizaron ensayos de MTS con tiloronetratamiento de fibroblastos prostáticos humanos (Fig. 3B). La sensibilidad de estas células a la totilorona fue similar a la de las células de control PC3.

El efecto inhibitorio de la tilorona en las células PC3 se evaluó posteriormente mediante ensayos clonogénicos (Fig. 3C). Las células CDK5dn de PC3 también fueron significativamente más sensibles a la tilorona que las células de control de PC3 en este ensayo. El tratamiento con tilorona de 10 µM dio lugar a una supervivencia clonogénica del 40% en las células CDK5dn de PC3 y del 72% en las células control de PC3(p=0,002).

Se realizó un ensayo de crecimiento de esferoides para evaluar el crecimiento de 3D tumores y la invasión de células PC3 tras el tratamiento con tilorona (Fig. 4). Tanto las células de control PC3 como las células PC3CDK5dn tuvieron aumentos comparables en el tamaño de los esferoides durante seis días. Sin embargo, el tamaño total (el tamaño de los esferoides más los brotes) tuvo un aumento mayor en las células de control de PC3, confirmando que las células CDK5dn de PC3 no tratadas tenían un potencial invasivo disminuido en comparación con las células de control de PC3. Cuando se administró tilorona a 5 µm, los esferoides de control de PC3 tuvieron un crecimiento y patrones invasivos similares a los de las células de control de PC3 no tratadas (p = 0,59) (Fig. 4B, gráfico izquierdo). Sin embargo, se observó una disminución significativa tanto en el tamaño esferoide como en el tamaño total (p<0,01), lo que sugiere que la tilorona inhibe con éxito el crecimiento esferoide y la invasión de las células PC3 CDK5dn cuando se administra a 5 µM (Fig. 4B, gráfico derecho). A 10 µM, ambas líneas celulares isogénicas tenían un potencial invasivo disminuido.

Discusión

El JHDL, una biblioteca de compuestos farmacéuticos bien caracterizados, se desarrolló para facilitar los estudios de reutilización de medicamentos (29). La amplia toxicidad in vivo y los perfiles farmacocinéticos de los compuestos de la biblioteca permiten un rápido desarrollo posterior de estos compuestos. Se han avanzado varios compuestos de la JHDL a ensayos clínicos para el cáncer y otras aplicaciones terapéuticas (13,14,16,17,30–32).

En el presente estudio, examinamos la JHDL en busca de compuestos que inhiben diferencialmente el crecimiento de células cancerosas en la presencia de inhibición de CDK5; la tilorona y un análogo de la tilorona se identificaron como agentes que se dirigen selectivamente a las células cancerosas del estado de PC3 con deficiencia de CDK5. La tilorona (Amixina IC) se emplea clínicamente en algunos países como agente antiviral activo por vía oral (25). La tilorona se ha probado en humanos para el tratamiento de gliomas cerebrales, papilomatosis laríngea y cáncer de mama (28,33,34).Aunque se notificó eficacia antitumoral, el interés en el tratamiento con tilorona para el cáncer ha disminuido. Recientemente, Zhou et al informaron de nuevos análogos de tilorona con actividad anticancerígena mejorada (35). Estos análogos pueden ser prometedores para la examina, particularmente en combinación con inhibición de CDK5.

Además de la posibilidad de que la tilorona sea prometedora en combinación con la inhibición de CDK5, la identificación de la tilorona como agente que se dirige selectivamente a las células con CDK5 inactiva sugiere clases potenciales de fármacos para potenciar la eficacia de la inhibición de CDK5. La tilorona se ha caracterizado como inductor de uninterferón (24). Esto sugiere que el interferón en sí mismo, o un interferón inductor alternativo, como un agonista de TLR, pueden ser útiles en combinación con un inhibidor de aCDK5. No obstante, pueden intervenir otros mecanismos. Por ejemplo, la tilorona también es un agente intercalador de ADN (24) y uno puede imaginar que puede modular la estructura de la cromatina y la expresión génica. Otras funciones de tilorona, incluyendo la vía de señalización y las interacciones de factores de transcripción (36,37), también pueden estar involucradas. Se necesitan más estudios para desentrañar el mecanismo exacto de acción por el cual la florona se dirige selectivamente a las células de cáncer de próstata CDK5 negativas.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer al Profesor P. J. Van Diestand E. Van der Wall por su apoyo, discusión y profesorado.A. Carducci y J. T. Isaacs por su suministro de materiales de laboratorio. Este estudio fue apoyado por el Instituto de Investigación Médica para Azafatas de Vuelo, NCI R01 CA085567, R01 CA134767, DOD grantW81XWH-06-1-0139 y NCI SPORE grant P50 CA58236. El Dr. Saal van Zwanenbergstichting y el Programa de becas Huygenss.