La tinción multicolor con tintes fluorescentes se utiliza activamente para observar la distribución de materiales biológicos (como proteínas, lípidos, ácidos nucleicos e iones) en el campo de la investigación de tejidos y células. La tecnología de detección para la observación de fluorescencia ha avanzado a un nivel en el que se puede detectar una sola molécula de tinte fluorescente en las mejores circunstancias. Esta sección revisa varios de los aspectos importantes de la microscopía de imágenes de por vida de fluorescencia (FLIM), una nueva tecnología de microscopía de fluorescencia. Además de la tinción multicolor, las imágenes de duración de la fluorescencia también se pueden utilizar para visualizar los factores que afectan las propiedades de duración de la fluorescencia de la molécula de tinte, es decir, el estado del entorno alrededor de la molécula.
Espectroscopia de longitud de onda
La microscopía de fluorescencia convencional hace uso de las propiedades de color de los tintes fluorescentes, es decir, la identificación se basa en las diferencias en las características espectrales de fluorescencia entre los tintes. Con esta técnica, cinco o seis tintes en el rango de longitud de onda del ultravioleta al infrarrojo cercano se pueden usar simultáneamente bajo microscopía sin confusión entre colores.
Espectroscopia de por vida
Cada tinte fluorescente tiene su propia vida útil en el estado excitado. Al detectar diferencias en la vida útil, es posible distinguir incluso tintes que tienen el mismo color fluorescente, así como identificar autofluorescencia. Además, se pueden obtener imágenes de alta señal a ruido utilizando una sonda con una vida útil muy larga en comparación con la de los tintes fluorescentes utilizados normalmente. Por ejemplo, la coproporfirina de platino tiene una vida útil de orden de milisegundos, mientras que la vida útil de los tintes fluorescentes ordinarios es de orden de nanosegundos. Estos tintes fluorescentes de vida relativamente larga pronto se utilizarán como sondas para la detección de ADN en chips.
Las imágenes de fluorescencia de por vida también permiten obtener información sobre las moléculas mientras se observa una célula viva. Los factores que afectan la vida útil de la fluorescencia incluyen la intensidad de iones, las propiedades hidrofóbicas, la concentración de oxígeno, la unión molecular y la interacción molecular por transferencia de energía cuando dos proteínas se acercan entre sí. Sin embargo, la vida útil es independiente de la concentración de tinte, el fotoblanqueo, la dispersión de la luz y la intensidad de la luz de excitación. Por lo tanto, las imágenes de fluorescencia de por vida nos permiten realizar mediciones precisas de concentración de iones y análisis de Transferencia de Energía de Resonancia de Fluorescencia (TRASTE).
Hay dos métodos de obtención de imágenes de fluorescencia de por vida: el método del dominio del tiempo y el método del dominio de la frecuencia.
- FLIM de dominio de tiempo: En algunos casos de retardo después de la excitación por un láser de pulso, la imagen de fluorescencia se puede obtener mediante la operación de compuerta del intensificador de imagen. La vida útil se mide en nanosegundos mediante un láser con una duración de pulso de unos pocos cientos de picosegundos y un obturador de nivel de nanosegundos, ya que la vida útil de un estado de excitación suele ser de 1 a 20 nanosegundos. Un intensificador de imagen de puerta de alta velocidad está disponible comercialmente en Hamamatsu Photonics K. K. (Hamamatsu, Japón). La vida útil de la fluorescencia en cada píxel también se puede obtener midiendo mientras varía el tiempo de retardo hasta que se abre una puerta. Las imágenes de vida útil de fluorescencia se muestran en pseudocolor de acuerdo con su vida útil.
- La vida útil de la fluorescencia FLIM de dominio de frecuencia se calcula midiendo el cambio de fase de la fluorescencia y la reducción de su amplitud utilizando un detector con un modulador de ganancia cuando se modula el láser utilizado como fuente de luz de excitación (1 a 200 megahercios). La medición puede realizarse mediante escaneo láser (fotomultiplicador) o mediante un dispositivo de acoplamiento de carga (CCD).
Aplicaciones
El entorno que rodea la sonda se detecta en función del hecho de que la vida útil de la fluorescencia es sensible a la concentración de iones de hidrógeno (pH), oxígeno y concentraciones de iones de calcio. La unión o la interacción entre moléculas también se puede medir en combinación con el TRASTE.
Obtención de imágenes de concentración de iones de calcio
Cuando el ion de calcio se une a una sonda fluorescente como Fura-2, Fluo-3 o Calcium Green, tanto la vida útil de la fluorescencia como la intensidad de la fluorescencia cambian. El procedimiento convencional para la medición de la concentración de iones se centra en el cambio de intensidad. De acuerdo con el cambio de la concentración de iones de calcio, la relación de colorantes entre los iones de calcio unidos y no unidos cambia, y esto conduce posteriormente a un cambio en la vida útil de fluorescencia del punto de medición en la muestra. Además de la sonda de iones de calcio, esta técnica también es aplicable a la medición de pH y otros iones como el ion de sodio y el ion de magnesio.
Transferencia de Energía de Resonancia de fluorescencia (TRASTE)
Actualmente se está llevando a cabo una investigación en TRASTE con variantes de proteína fluorescente verde (GFP) (GFP con un color de fluorescencia diferente). FRET permite medir las interacciones (asociación o disociación) entre dos proteínas que están etiquetadas con un par de colorantes de fluorescencia. Un tinte fluorescente donante tiene longitudes de onda de excitación/emisión más cortas que proporcionan energía a un tinte de fluorescencia aceptor. La vida útil del estado de excitación del tinte donante es variable dependiendo de si existe o no el aceptador (el tinte que recibe la energía). La medición basada en la vida útil permite una mejor cuantificación porque no es necesario considerar la superposición de fluorescencia durante la detección.
Imágenes clínicas
Como algunas muestras de tejido y citodiagnóstico tienen una fuerte autofluorescencia, se ha intentado el uso de sondas de larga duración (hasta milisegundos). Las sondas de larga vida útil también son útiles en la hibridación fluorescente in situ (FISH) porque el número de colores que se pueden usar simultáneamente es limitado con esta técnica. La concentración de iones de hidrógeno en la sangre, así como las presiones de oxígeno y dióxido de carbono, ya se han medido en función de la vida útil de la fluorescencia, aunque tales mediciones aún no son posibles bajo microscopía.
Recursos de Internet
- Centro de Espectroscopia de Fluorescencia-Presentado por el Profesor Joseph R. Lakowicz de la Universidad de Maryland, este sitio web es un excelente recurso para obtener información sobre imágenes de fluorescencia de por vida y otros aspectos de la espectroscopia de fluorescencia y la microscopía.
- Kentech Instruments-Kentech fabrica generadores de impulsos de estado sólido de alto voltaje y sistemas de imágenes ópticas cerradas para imágenes de fluorescencia de por vida.
- Hamamatsu Photonics – Además de su excelente gama de sistemas de cámaras digitales, Hamamatsu también fabrica fotomultiplicadores, fotodiodos de avalancha e intensificadores de imagen de puerta de alta velocidad.
- PRS BioSciences-Especializada en microscopía de fluorescencia biológica, PRS BioSciences fabrica un sistema de tiempo limitado para el mercado de accesorios que se puede adaptar a muchos microscopios de investigación.
