RESUMEN
La neuraminidasa (NA) del virus de la gripe desempeña un papel esencial en la liberación y propagación de viriones de la progenie, tras el ciclo de replicación viral intracelular. Para probar si la NA también podría facilitar la entrada del virus en las células, infectamos cultivos de epitelio de las vías respiratorias humanas con virus de influenza humana y aviar en presencia del inhibidor de NA oseltamivir carboxilato. Entre veinte y 500 veces menos células se infectaron en cultivos tratados con medicamentos versus cultivos no tratados (P < 0,0001) 7 h después de la aplicación del virus, lo que indica que el medicamento suprimió el inicio de la infección. Estos datos demuestran que la NA viral juega un papel temprano en la infección, y proporcionan una justificación adicional para el uso profiláctico de inhibidores de NA.
Se cree que la función principal de la neuraminidasa viral (NA) se encuentra en la fase final de la infección, cuando la NA escinde el ácido siálico de la superficie celular y los viriones de la progenie facilitando la liberación del virus de las células infectadas (1, 2). Se sabe menos sobre las funciones de NA durante la entrada del virus en la célula. Durante mucho tiempo se ha asumido que la NA promueve el acceso del virus a las células diana de las vías respiratorias mediante la degradación del moco (3). Sin embargo, este concepto nunca ha sido probado formalmente debido a la falta de un sistema experimental adecuado. Además, se han notificado algunas pruebas que argumentan en contra del papel de la NA en las primeras etapas de la infección (revisado en la referencia 2).
Para abordar este problema, estudiamos los efectos del inhibidor de NA oseltamivir carboxilato (OC) (9) en la entrada del virus de la gripe en cultivos de epitelio de las vías respiratorias humanas. Las células epiteliales traqueobronquiales humanas primarias (HTBE; Clonetics) y las células epiteliales nasales primarias (PromoCell GmbH) se cultivaron en soportes de membrana (Transwell-Clear de 12 mm; Corning, Inc.) en la interfaz aire-líquido en factor de crecimiento sin suero y medio suplementado con hormonas (6, 8). Para todos los experimentos se utilizaron cultivos totalmente diferenciados de 4 a 8 semanas de edad. Estos cultivos estaban pseudoestratificados y polarizados; contenían células basales, ciliadas y secretoras de moco; y se parecían mucho al epitelio de las vías respiratorias humanas in vivo (Fig. 1). Se añadió OC (1 µM, si no se indica lo contrario) a las suspensiones de virus y a los compartimentos basolaterales de los cultivos poco antes de infectar dos cultivos replicados por el lado apical. Se infectaron dos cultivos de control en ausencia de inhibidor. Una hora después de la infección, retiramos el inóculo del virus e incubamos cultivos en la interfaz aire-líquido durante 6 horas adicionales para permitir la replicación del virus intracelular. Los cultivos se repararon y las células infectadas se identificaron mediante tinción con antisueros policlonales a virus enteros, seguidos de anticuerpos secundarios marcados con peroxidasa (Dianova) y sustrato de aminoetilcarbazol (Sigma). La tinción positiva indicó la entrada exitosa del virus en la célula. Los cultivos se analizaron en la cara con un aumento de ×300 (Olympus IMT-2). Se contó un número total de células que expresaban antígeno viral en el segmento epitelial que incluyó todas las vistas microscópicas consecutivas (0,28 por 0,42 mm) a lo largo del diámetro del cultivo (área de superficie del segmento, 3 mm2; número de células por segmento, aproximadamente 30.000). Se contaron cuatro segmentos por cultivo girando el cultivo en el sentido de las agujas del reloj 45o, y se promediaron los datos de ocho segmentos de dos cultivos replicados.
En dos experimentos con cultivos HTBE, el virus humano A/Memphis / 14 / 96 (H1N1) infectó 22 y 65 veces menos células en presencia de inhibidor de NA en comparación con los controles (Fig. 2; Cuadro 1) (P < 0,0001). Los virus A / Duck/Alberta/119/98 (H1N1) de aves acuáticas silvestres y A/Turkey/Italy/2379 / 99 (H7N1) de aves de corral domésticas también fueron notablemente sensibles al OC en estos cultivos. En cultivos epiteliales nasales, el OC redujo la infección por virus humano y de pato 120 y 520 veces, respectivamente. Estos resultados indicaron que la inhibición de la NA viral suprime el inicio de la infección vírica.
A / Chicken / Germany/R28 / 03 (H7N7) pertenece al linaje de virus de la gripe aviar altamente patógena que causó el brote de peste aviar en granjas avícolas comerciales de los Países Bajos, Bélgica y Alemania en 2003. Estos virus se transmitieron al menos a 89 seres humanos, la mayoría de los cuales presentaban conjuntivitis, pero también se produjo un caso mortal de neumonía (5). La infección por el virus de pollo H7N7 en cultivos de HTBE se redujo 140 y 40 veces en presencia de 1 y 0,1 µM de OC, respectivamente. Estas concentraciones representaban las concentraciones plasmáticas máximas y mínimas típicas del fármaco alcanzadas en humanos tras la administración de 75 mg de fosfato de oseltamivir, la dosis recomendada para la profilaxis (9).
Para confirmar la hipótesis de que la inhibición de la infección en nuestros experimentos estaba directamente relacionada con la inhibición de la actividad enzimática viral NA, utilizamos A humana / Sydney/5/97-como el virus (H3N2) y su mutante resistente a oseltamivir con una sustitución R292K en el NA, que hace que el NA sea 9.000 veces menos sensible a la inhibición por OC (4). De acuerdo con la hipótesis, el virus humano original fue fuertemente inhibido por OC, mientras que solo se observó un nivel marginal de inhibición del mutante resistente cuando ambos virus se probaron en el mismo experimento en cultivos de HTBE (Tabla 1). Hasta ahora, no se ha dispuesto de un ensayo de cultivo celular adecuado para controlar la resistencia del virus de la gripe a los inhibidores de NA debido a la falta de correspondencia entre los receptores de ácido siálico en humanos y en líneas celulares de laboratorio convencionales (9, 11). Nuestros resultados sugieren que los cultivos diferenciados de epitelio de las vías respiratorias humanas pueden ser un sistema de cultivo celular adecuado para la detección de la resistencia del virus de la gripe a los inhibidores de NA.
Finalmente, usar el A/Sydney sensible a las drogas/5/97-al igual que el virus, probamos la inhibición de la infección por OC agregado en diferentes momentos después de la inoculación del virus. Mientras que se infectaron 47 veces menos células cuando se añadió el fármaco poco antes de la infección, un retraso de 1 hora además de OC solo produjo una inhibición de 1,5 veces con respecto al control no tratado (Tabla 1). Si el fármaco se añadió 4 h después de la inoculación del virus, no se observó inhibición estadísticamente significativa. Estos datos sugirieron que el OC afectaba a las primeras etapas de la infección que precedían a la replicación del virus.
En resumen, hemos proporcionado aquí por primera vez evidencia experimental directa del papel esencial de la NA en la etapa de invasión viral del epitelio ciliado de las vías respiratorias humanas. La función de NA en esta etapa es probablemente la eliminación de los receptores señuelo en mucinas, cilios y glicocálix celular, una fuerte unión a cada uno de los cuales impediría el acceso del virus a los receptores funcionales en la membrana superficial de las células diana. Sin embargo, no se pueden excluir otras funciones de NA, por ejemplo, la promoción de la fusión mediada por hemaglutinina (7), y se necesitan más estudios para especificar los mecanismos exactos por los que la NA promueve la entrada del virus en las células epiteliales de las vías respiratorias.
Aún no se dispone de una vacuna contra los virus de la gripe aviar H7N7 y H5N1 altamente patógenos, los medicamentos antivirales siguen siendo la única opción para combatir la gripe aviar (10). En comparación con otros agentes antigripales, los inhibidores de la NA son bien tolerados y eficaces contra todas las cepas de los virus A y B de la gripe. Ha habido poca evidencia de la aparición de resistencia viral, y la infectividad de los virus mutantes generalmente está comprometida (9, 11). La capacidad de los inhibidores de NA para suprimir la infección antes de la entrada del virus en las células subraya su alto potencial para medidas preventivas. En particular, nuestros datos proporcionan la base científica para apoyar el uso profiláctico de estos compuestos para personas con alto riesgo de infección por el virus de la influenza aviar.
