Purificación de proteíaseditar
Las etiquetas de polihistidina se utilizan a menudo para la purificación de afinidad de proteínas recombinantes marcadas con polihistidina expresadas en Escherichia coli y otros sistemas de expresión procariótica. Las células bacterianas se recolectan por centrifugación y el gránulo de células resultante se lisan por medios físicos o por medio de detergentes y enzimas, como lisozima o cualquier combinación de estos. En esta etapa, el lisado crudo contiene la proteína recombinante entre muchas otras proteínas originarias del huésped bacteriano. Esta mezcla se incuba con una resina de afinidad que contiene iones divalentes de níquel o cobalto unidos, que están disponibles comercialmente en diferentes variedades. El níquel y el cobalto tienen propiedades similares y son metales de transición adyacentes del período 4 (v. tríada de hierro). Estas resinas son generalmente sefarosa/agarosa funcionalizadas con un quelante, como el ácido iminodiacético (Ni-IDA) y el ácido nitrilotriacético (Ni-NTA) para el níquel y el carboxil-metil aspartato (Co-CMA) para el cobalto, al que la polihistidina-tag se une con afinidad micromolar. Ernst Hochuli et al. acoplado en 1987 el ligando NTA y los iones de níquel a perlas de agarosa. La resina se lava con tampón de fosfato para eliminar las proteínas que no interactúan específicamente con el ion cobalto o níquel. Con métodos basados en Ni, la eficiencia de lavado se puede mejorar mediante la adición de 20 mm de imidazol (las proteínas generalmente se eluyen con 150-300 mm de imidazol). En general, las resinas a base de níquel tienen una mayor capacidad de unión, mientras que las resinas a base de cobalto ofrecen la mayor pureza. La pureza y la cantidad de proteína se pueden evaluar mediante SDS-PAGE y Western blotting.
La purificación de afinidad utilizando una etiqueta de polihistidina generalmente da como resultado una proteína relativamente pura cuando la proteína recombinante se expresa en organismos procarióticos. Dependiendo de las aplicaciones posteriores, incluida la purificación de complejos de proteínas para estudiar las interacciones de proteínas, la purificación de organismos superiores, como levaduras u otros eucariotas, puede requerir una purificación de afinidad en tándem utilizando dos etiquetas para obtener una mayor pureza. Alternativamente, la purificación de un solo paso utilizando iones de cobalto inmovilizados en lugar de iones de níquel generalmente produce un aumento sustancial en la pureza y requiere concentraciones más bajas de imidazol para la elución de la proteína marcada con his.
El marcado con polihistidina es la opción de elección para purificar proteínas recombinantes en condiciones de desnaturalización porque su modo de acción depende solo de la estructura primaria de las proteínas. Por ejemplo, incluso cuando una proteína recombinante se expresa forzosamente en E. coli produce un cuerpo de inclusión y no se puede obtener como una proteína soluble, se puede purificar con desnaturalización con clorhidrato de urea o guanidina. En general, para este tipo de técnica, la unión de histidina se titula utilizando pH en lugar de unión de imidazol: a un pH alto, la histidina se une al níquel o al cobalto, pero a un pH bajo (~6 para el cobalto y ~4 para el níquel), la histidina se protona y compite con el ion metálico. Compare esto con la purificación de anticuerpos y la purificación de GST, un requisito previo para el cual es el plegado adecuado (nativo) de las proteínas involucradas. Por otro lado, se dice que la etiqueta His tiende a agregarse e insolubilizarse más que otras etiquetas de afinidad.
Las columnas de etiqueta de polihistidina retienen varias proteínas bien conocidas como impurezas. Una de ellas es la peptidil isomerasa prolil de tipo FKBP, que aparece alrededor de 25 kDa (SlyD). Las impurezas generalmente se eliminan utilizando una técnica cromatográfica secundaria, o expresando la proteína recombinante en una cepa de E. coli deficiente en SlyD. Alternativamente, en comparación con las resinas a base de níquel, a base de cobalto tienen menos afinidad con SlyD de E. coli, pero en varios casos, es moderadamente útil.
Separando una de dos etiquetas de polihistidinaeditar
Las proteínas con diferentes números de etiquetas de polihistidina elutan de manera diferente a la resina de afinidad por el níquel. Para las proteínas con una sola etiqueta de hexahistidina, el imidazol de 75 mm permite la elución a partir de Ni-NTA, mientras que para las proteínas con dos etiquetas de hexahistidina, se requiere imidazol de 100 mm para la elución. Esta elución escalonada puede utilizarse para aislar conjuntos proteicos específicos de una mezcla, como heteromultimeros definidos (por ejemplo, un heterodímero AB de una mezcla que incluya homodímeros AA y BB, si solo la subunidad B tiene una etiqueta de polihistidina). Este enfoque se utilizó aisladamente de la estreptavidina monovalente.
Ensayos de ligacióneditar
El marcado con polihistidina se puede utilizar para detectar interacciones proteína-proteína de la misma manera que un ensayo desplegable. Sin embargo, esta técnica generalmente se considera menos sensible, y también está restringida por algunos de los aspectos más meticulosos de esta técnica. Por ejemplo, no se pueden usar condiciones reductoras, EDTA y muchos tipos de detergentes no se pueden usar. Los avances recientes en interferometría de polarización dual son susceptibles al EDTA y a un uso más amplio de reactivos, y el uso de tales etiquetas específicas del sitio simplifica en gran medida la medición directa del cambio conformacional asociado.
Etiquetas fluorescenteseditar
También se han desarrollado etiquetas hexahistadina CyDye. Estos usan coordinación covalente de níquel con grupos EDTA unidos a fluoróforos para crear tintes que se adhieren a la etiqueta de polihistidina. Esta técnica ha demostrado ser eficaz para seguir la migración y el tráfico de proteínas. También ha habido descubrimientos recientes que muestran que esta técnica puede ser efectiva para medir la distancia a través de la Transferencia de Energía de Resonancia Fluorescente.
Etiqueta de fluorohistidinaeditar
Se ha notificado una etiqueta de polifluorohistidina para su uso en sistemas de traducción in vitro. En este sistema, se utiliza un código genético expandido en el que la histidina se reemplaza por 4-fluorohistidina. El análogo fluorado se incorpora a los péptidos a través de la especificidad de sustrato relajado de la ligasa histidina-ARNt y reduce el pKa general de la etiqueta. Esto permite el enriquecimiento selectivo de péptidos marcados con polifluorohistidina en presencia de mezclas complejas de etiquetas tradicionales de polihistidina alterando el pH de los tampones de lavado.
