Métodos de Purificación de Proteínas: 4 Métodos

Este artículo arroja luz sobre los cuatro métodos de purificación de proteínas.

Los cuatro métodos de purificación de proteínas son: (1) Extracción (2) Precipitación y Solubilización Diferencial (3)Ultracentrifugación y (4) Métodos Cromatográficos.

Los métodos utilizados en la purificación de proteínas, se pueden dividir aproximadamente en métodos analíticos y preparativos.

La distinción no es exacta, pero el factor decisivo es la cantidad de proteína, que prácticamente se puede purificar con ese método. Los métodos analíticos tienen como objetivo detectar e identificar una proteína en una mezcla, mientras que los métodos preparativos tienen como objetivo producir grandes cantidades de la proteína para otros fines, como la biología estructural o el uso industrial. En general, los métodos preparativos se pueden utilizar en aplicaciones analíticas, pero no al revés.

Método # 1. Extracción:

Dependiendo de la fuente, la proteína debe disolverse rompiendo el tejido o las células que la contienen. Hay varios métodos para lograr esto; Congelación y descongelación repetidas, sonicación, homogeneización por alta presión o permeabilización por solventes orgánicos. El método de elección depende de cuán frágil sea la proteína y cuán robustas sean las células.

Después de este proceso de extracción, la proteína soluble estará en el disolvente y se puede separar de las membranas celulares, el ADN, etc. por centrifugación. El proceso de extracción también extrae proteasas, que comenzarán a digerir las proteínas en la solución. Si la proteína es sensible a la proteólisis, por lo general es deseable proceder rápidamente, y mantener el extracto enfriado, para ralentizar la proteólisis.

Método # 2. Precipitación y Solubilización diferencial:

En la purificación de proteínas a granel, un primer paso común para aislar proteínas es la precipitación con sulfato de amonio (NH4)2SO4. Esto se realiza añadiendo cantidades crecientes de sulfato de amonio y recogiendo las diferentes fracciones de proteína precipitada. Una ventaja de este método es que se puede realizar de forma económica con volúmenes muy grandes.

Las primeras proteínas que se purifican son las proteínas solubles en agua. La purificación de proteínas integrales de membrana requiere la interrupción de la membrana celular para aislar una proteína en particular de otras que están en el mismo compartimiento de membrana. A veces, una tracción de membrana en particular se puede aislar primero, como aislar las mitocondrias de las células antes de purificar una proteína ubicada en una membrana mitocondrial.

Un detergente como el sulfato de dodecilo de sodio (SDS) se puede usar para disolver membranas celulares y mantener las proteínas de membrana en solución durante la purificación; sin embargo, debido a que el SDS causa desnaturalización, se pueden usar detergentes más suaves como Triton X-100 o CHAPS para retener la conformación nativa de la proteína durante la purificación.

Método # 3. Ultracentrifugación:

La centrifugación es un proceso que utiliza la fuerza centrífuga para separar mezclas de partículas de masas o densidades variables suspendidas en un líquido. Cuando un recipiente (típicamente un tubo o botella) que contiene una mezcla de proteínas u otras partículas, como células bacterianas, gira a altas velocidades, el momento angular produce una fuerza hacia afuera para cada partícula que es proporcional a su masa.

La tendencia de una partícula dada a moverse a través del líquido debido a esta fuerza se compensa con la resistencia que el líquido ejerce sobre la partícula. El efecto neto de «girar» la muestra en una centrífuga es que las partículas masivas, pequeñas y densas se mueven hacia afuera más rápido que las partículas menos masivas o las partículas con más «arrastre» en el líquido.

Cuando las suspensiones de partículas se » hilan «en una centrifugadora, en el fondo del recipiente se puede formar una» bolita » enriquecida para las partículas más masivas con baja resistencia en el líquido. Las partículas no compactadas restantes que aún permanecen en su mayor parte en el líquido se denominan «sobrenadante» y se pueden eliminar del recipiente para separar el sobrenadante del gránulo.

La velocidad de centrifugación se especifica mediante la aceleración angular aplicada a la muestra, medida típicamente en comparación con el g. Si las muestras se centrifugan el tiempo suficiente, las partículas en el recipiente alcanzarán un equilibrio en el que las partículas se acumulan específicamente en un punto del recipiente en el que su densidad de flotación se equilibra con la fuerza centrífuga. Tal centrifugación de «equilibrio» puede permitir una purificación extensa de una partícula dada.

Centrifugación con gradiente de sacarosa:

Se genera un gradiente de concentración lineal de azúcar (típicamente sacarosa glicerol, o Percoll) en un tubo de tal manera que la concentración más alta está en la parte inferior y la más baja en la parte superior. Una muestra de proteína se coloca en capas en la parte superior del gradiente y se gira a altas velocidades en una ultracentrífuga. Esto hace que las macromoléculas pesadas migren hacia el fondo del tubo más rápido que el material más ligero.

Durante la centrifugación en ausencia de sacarosa, a medida que las partículas se mueven cada vez más lejos del centro de rotación, experimentan más y más fuerza centrífuga (cuanto más se mueven, más rápido se mueven). El problema con esto es que el útil rango de separación dentro del recipiente está restringido a una pequeña ventana observable.

Girar una muestra el doble de largo no significa que la partícula de interés vaya el doble de lejos; de hecho, irá significativamente más lejos. Sin embargo, cuando las proteínas se mueven a través de un gradiente de sacarosa, se encuentran con un líquido de densidad y viscosidad crecientes.

Un gradiente de sacarosa correctamente diseñado contrarrestará la creciente fuerza centrífuga, por lo que las partículas se mueven en estrecha proporción con el tiempo que han estado en el campo centrífugo. Las muestras separadas por estos gradientes se denominan centrifugaciones de «frecuencia zonal». Después de separar la proteína / partículas, el gradiente se fracciona y se recoge.

Método # 4. Métodos Cromatográficos:

Por lo general, un protocolo de purificación de proteínas contiene uno o más pasos cromatográficos. El procedimiento básico en cromatografía es hacer fluir la solución que contiene la proteína a través de una columna llena de diversos materiales. Diferentes proteínas interactúan de manera diferente con el material de la columna, y por lo tanto se pueden separar por el tiempo requerido para pasar la columna, o las condiciones requeridas para eluir la proteína de la columna. Por lo general, las proteínas se detectan a medida que salen de la columna por su absorbancia a 280 nm.

Existen muchos métodos cromatográficos diferentes:

1. Cromatografía de exclusión de tamaño:

La cromatografía se puede utilizar para separar proteínas en solución o en condiciones de desnaturalización mediante el uso de geles porosos. Esta técnica se conoce como cromatografía de exclusión de tamaño. El principio es que las moléculas más pequeñas tienen que atravesar un volumen mayor en una matriz porosa. Consecuentemente, las proteínas de un cierto rango de tamaño requerirán un volumen variable de eluante (disolvente) antes de ser recolectadas en el otro extremo de la columna de gel.

En el contexto de la purificación de proteínas, el eluante generalmente se agrupa en diferentes tubos de ensayo. Se desechan todos los tubos de ensayo que no contengan trazas medibles de la proteína a purificar. La solución restante está hecha de la proteína para purificar y cualquier otra proteína de tamaño similar.

2. Cromatografía de intercambio iónico:

La cromatografía de intercambio iónico separa los compuestos de acuerdo con la naturaleza y el grado de su carga iónica. La columna a utilizar se selecciona de acuerdo con su tipo y fuerza de carga. Las resinas intercambiadoras de aniones tienen una carga positiva y se utilizan para retener y separar las moléculas cargadas negativamente, mientras que las resinas intercambiadoras de cationes tienen una carga negativa y se utilizan para separar moléculas cargadas positivamente.

Antes de que comience la separación, se bombea un tampón a través de la columna para equilibrar los iones cargados opuestos. Tras la inyección de la muestra, las moléculas de soluto se intercambiarán con los iones tampón a medida que cada uno compite por los sitios de unión de la resina. La duración de retención de cada soluto depende de la fuerza de su carga.

Los compuestos con carga más débil se eluirán primero, seguidos por aquellos con cargas sucesivamente más fuertes. Debido a la naturaleza del mecanismo de separación, el pH, el tipo de tampón, la concentración de tampón y la temperatura juegan un papel importante en el control de la separación. La cromatografía de intercambio iónico es una herramienta muy poderosa para su uso en la purificación de proteínas y se usa con frecuencia en separaciones analíticas y preparativas.

3. Cromatografía de Afinidad:

La cromatografía de afinidad es una técnica de separación basada en la conformación molecular, que utiliza con frecuencia resinas específicas de aplicación. Estas resinas tienen ligandos unidos a sus superficies que son específicos para los compuestos a separar. Con mayor frecuencia, estos ligandos funcionan de manera similar a la de las interacciones anticuerpo-antígeno. Este ajuste de «cerradura y llave» entre el ligando y su compuesto objetivo lo hace altamente específico, generando con frecuencia un solo pico, mientras que todo lo demás en la muestra no se retiene.

Muchas proteínas de membrana son glicoproteínas y pueden purificarse mediante cromatografía de afinidad por lectina. Se puede permitir que las proteínas solubilizadas con detergente se unan a una resina de cromatografía que se haya modificado para tener una lectina unida covalentemente.

Las proteínas que no se unen a la lectina se lavan y luego se pueden eluir glicoproteínas específicamente unidas agregando una alta concentración de azúcar que compita con las glicoproteínas unidas en el sitio de unión de la lectina. Algunas lectinas tienen una unión de alta afinidad a oligosacáridos de glicoproteínas que es difícil de competir con los azúcares, y las glicoproteínas unidas deben liberarse desnaturalizando la lectina.

4. Unión de metales:

Una técnica común implica la ingeniería de una secuencia de 6 a 8 histidinas en el terminal C de la proteína. La polihistidina se une fuertemente a iones metálicos divalentes como el níquel y el cobalto. La proteína se puede pasar a través de una columna que contiene iones de níquel inmovilizados, que se une a la etiqueta de polihistidina. Todas las proteínas sin etiquetar pasan a través de la columna.

La proteína se puede eluir con imidazol, que compite con la etiqueta de polihistidina para unirse a la columna, o por una disminución en el pH (típicamente a 4,5), lo que disminuye la afinidad de la etiqueta por la resina. Si bien este procedimiento se usa generalmente para la purificación de proteínas recombinantes con una etiqueta de afinidad diseñada (como una etiqueta 6xHis o la etiqueta HAT de Clontech), también se puede usar para proteínas naturales con cationes divalentes tor de afinidad inherente.

5. Cromatografía de Inmunoafinidad:

La cromatografía de inmunoafinidad utiliza la unión específica de un anticuerpo a la proteína diana para purificar selectivamente la proteína. El procedimiento consiste en inmovilizar un anticuerpo a un material de columna, que luego se une selectivamente a la proteína, mientras que todo lo demás fluye a través. La proteína puede ser eluida cambiando el pH o la salinidad. Debido a que este método no implica ingeniería en una etiqueta, se puede usar para proteínas de fuentes naturales.

6. HPLC:

La cromatografía líquida de alto rendimiento o la cromatografía líquida de alta presión es una forma de cromatografía que aplica alta presión para conducir los solutos a través de la columna más rápido. Esto significa que la difusión es limitada y se mejora la resolución. La forma más común es la CLAR de «fase inversa», donde el material de la columna es hidrofóbico.

Las proteínas son eluidas por un gradiente de cantidades crecientes de un disolvente orgánico, como el acetonitrilo. Las proteínas elute de acuerdo a su hidrofobicidad. Después de la purificación por HPLC, la proteína se encuentra en una solución que solo contiene compuestos volátiles y puede liofilizarse fácilmente. La purificación por HPLC con frecuencia resulta en la desnaturalización de las proteínas purificadas y, por lo tanto, no es aplicable a las proteínas que no se vuelven a plegar espontáneamente.