Breve Introducción: Blot Técnicas
Blot se utiliza en la biología molecular para la identificación de proteínas y ácidos nucleicos, y es ampliamente utilizado para fines de diagnóstico. Esta técnica inmoviliza la molécula de interés sobre un soporte, que es una membrana nitrocelulósica o nylon. Utiliza técnicas de hibridación para la identificación de los ácidos nucleicos y genes específicos.
La técnica de blot es una herramienta utilizada en la identificación de biomoléculas como ADN ad, ARNm y proteínas durante diferentes etapas de expresión génica. La síntesis de proteínas implica la expresión de un segmento de ADN que se convierte en ARNm para producir la proteína respectiva.
Subtipos de blotting como norte, oeste & sur dependen de la molécula objetivo que se busca. Cuando una secuencia de ADN es la base o el código de una molécula de proteína, la molécula de ADN particular de interés se puede borrar utilizando la técnica de borrado Sureño. Durante la expresión génica, cuando el ADN se expresa como ARNm para la producción de una proteína, este proceso se puede identificar mediante el seccionamiento del Norte. Finalmente, el ARNm codificado produce la proteína en cuestión, esta identificación de proteína se puede hacer mediante Western Blot.
Procedimiento general para el secado
- Homogeneizar la muestra.
- Separación de la molécula de interés por una membrana de electroforesis.
- Transferencia de las moléculas a una membrana nitrocelulósica / membrana de nylon.
- Hibridación o identificación de la molécula
Northern Blotting
Northern Blotting es una técnica utilizada para el estudio de la expresión génica. Se realiza mediante la detección de ARN particular (o ARNm aislado). El ARNm se representa generalmente como el 5% de la secuencia total de ARN. Este método revela la identidad, el número, la actividad y el tamaño del gen en particular. Esta técnica también se puede utilizar para el crecimiento de un tejido u organismo. En diferentes etapas de diferenciación y morfogénesis la abundancia de un ARN cambia y esto se puede identificar utilizando esta técnica. También ayuda en la identificación de condiciones anormales, enfermas o infectadas a nivel molecular. La técnica northern blot fue desarrollada en 1977 por James Alwine, David Kemp y George Stank en la Universidad de Stanford. La técnica recibió su nombre debido a la similitud del proceso con el borrado sureño. La principal diferencia entre estas dos técnicas es que el borrado norteño solo se refiere al ARN.
Principio
Como toda técnica de bloting normal, el bloting norte comienza con la electroforesis para separar las muestras de ARN por tamaño. La electroforesis separa las moléculas de ARN en función de la carga de los ácidos nucleicos. La carga en los ácidos nucleicos es proporcional al tamaño de la secuencia de ácidos nucleicos. Por lo tanto, la membrana de electroforesis separa la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el tamaño de la secuencia de ARN. En los casos en que nuestra secuencia objetivo es un ARNm, la muestra se puede aislar a través de técnicas cromatográficas de oligocelulosa, ya que los ARNm se caracterizan por la cola poli(A). Dado que las moléculas de gel son de naturaleza frágil, las secuencias separadas se transfieren a las membranas de nylon. La selección de la membrana de nylon contribuye al factor de que los ácidos nucleicos estén cargados negativamente en la naturaleza. Una vez que las moléculas de ARN se transfieren, se inmoviliza mediante enlace covalente. Luego se agrega la sonda, la sonda puede ser complementaria a una secuencia de ADN ss. La formamida se usa generalmente como tampón de secante, ya que reduce la temperatura de recocido.
Procedimiento
- La muestra de tejido o cultivo recogida se homogeneiza primero. Las muestras pueden ser representativas de diferentes tipos de cultivo para la comparación o para el estudio de diferentes etapas de crecimiento dentro del cultivo.
- La secuencia de ARN se separa en la unidad de electroforesis, se utiliza un gel de agarosa para la separación de ácidos nucleicos.
- Ahora la secuencia de ARN separada se transfiere a la membrana de nylon. Esto se realiza mediante dos mecanismos de acción capilar y la interacción iónica.
- La operación de transferencia se realiza manteniendo el gel en el siguiente orden. Primero, el gel de agarosa se coloca en la parte inferior de la pila, seguido de la membrana secante. Encima de estas toallas de papel se coloca un peso suave (placa de vidrio). Toda la configuración se guarda en un vaso de precipitados que contiene un búfer de transferencia.
- El ARN transferido a la membrana de nylon se fija mediante radiación UV.
- La membrana de nylon fija se mezcla con sondas. Las sondas están diseñadas específicamente para el gen de interés, de modo que se hibridan con secuencias de ARN en el blot correspondientes a la secuencia de interés.
- La membrana de la mancha seca se lava para eliminar la sonda no deseada
- La sonda etiquetada se detecta mediante quimioluminiscencia o autorradiografía. El resultado serán bandas oscuras en película de rayos x.
GEl y sondas
Las muestras de ARN se separan utilizando geles de agarosa utilizando formaldehído como agentes desnaturalizantes, pero en secuencias pequeñas de ARN o micro ARN, también se pueden usar secuencias de poliacrilamida con urea como agente desnaturalizante. El bromuro de etidio se puede utilizar como agente de tinción. Hay dos tipos de marcadores para marcar el tamaño. Se utiliza una escalera de ARN y una subunidad ribosómica para identificar el tamaño de las secuencias de ARN.Las sondas
pueden ser complementarias de la totalidad o parte del ARN de interés. Pueden ser ARN, ADN u oligonucleótidos de 25 pares de base complementarios al ARN diana. En el caso de las sondas de ARN, las sondas producidas por invitro se utilizan ya que las sondas invivo pueden desnaturalizarse debido al lavado riguroso. En caso de ADNc, las sondas están etiquetadas con isótopos radiactivos, fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante en caso de quimioluminiscencia.
