PMC

1 Los protocolos detallados y consejos de solución de problemas para todos los aspectos del sistema de expresión de proteínas de fusión de genes GST están disponibles en GE Healthcare en los manuales: Sistema de Fusión de Genes GST, número de producto 18-1157-58, y Manual de Proteínas Recombinantes, número de producto 18-1142-75. Los manuales están disponibles para su compra en forma impresa o se puede acceder a ellos en formato PDF en el sitio web de GE Healthcare.

2El uso de JM105 o una cepa similar se recomienda para la clonación y el mantenimiento del vector. Las cepas de BL21 y sus derivados, u otra cepa deficiente de proteasa, se recomiendan para la máxima expresión de proteínas. Las cepas deficientes en productos genéticos de proteasa citoplasmática como lon, ompT, degP o htpR pueden minimizar los efectos de la degradación proteolítica de la proteína sobreexpresada por el huésped. No use una cepa de E. coli que lleve el alelo rec1A para propagar plásmidos pGEX, ya que se han reportado deleciones o reordenamientos de ADN plásmido.

3glutatión Sefarosa 4B se utiliza en este protocolo de purificación. Este medio de cromatografía es ideal para condiciones de cribado y permite un fácil escalado. Las purificaciones se realizan fácilmente utilizando flujo por gravedad o un sistema de cromatografía de baja presión, o se pueden usar en purificaciones por lotes basadas en centrifugación. Las columnas de afinidad GSTrap FF son columnas preenvasadas de 1 ml o 5 ml que también están disponibles y se pueden conectar en serie para ampliarlas. Estas columnas son para usar con un sistema cromatográfico de líquidos, una bomba o una jeringa. Además de estos formatos, la glutatión sefarosa también está disponible en columnas centrifugadas y formatos de placa de 96 pocillos para el cribado rápido de las condiciones de expresión y purificación de la proteína de fusión GST.

4DFP es una neurotoxina extremadamente peligrosa. Siga las precauciones suministradas por el fabricante y manipule solo el reactivo puro en una campana extractora de humos químicos.

5 La adición de inhibidores de la proteasa al tampón de lisis ayudará a prevenir la degradación proteolítica de la proteína diana durante la extracción. Sin embargo, el cóctel exacto de inhibidores de la proteasa añadidos al tampón de lisis debe adaptarse a las características de la proteína diana. Se deben añadir agentes reductores como 2-ME, TDT o TCEP a concentraciones de 1-10 mm al tampón según sea necesario. La adición de un detergente no iónico, como Triton X-100 al 1%, también se puede agregar al tampón para ayudar en la extracción.

6El siguiente es un protocolo de detección para verificar los niveles de expresión de proteína de fusión en minicultivos. La presencia de un aumento en los niveles de proteínas al peso molecular esperado en un gel SDS-PAGE después de la inducción con IPTG es una buena indicación de una expresión proteica exitosa. Tras la inducción, debe ser visible una banda prominente con el peso molecular esperado (peso molecular de la proteína diana + ~ 26 kDa para la fracción GST). Si se sospecha que la proteína se expresa a un nivel bajo, la verificación de la expresión correcta se puede lograr utilizando Western blot con un anticuerpo específico para la proteína diana o GST. Si las muestras no se analizan inmediatamente con SDS-PAGE, se pueden almacenar durante la noche a 4 °C o a -20 °C para un almacenamiento a largo plazo.

1. Inocular varias colonias aisladas en tubos centrífugos de 50 ml separados que contengan 10 ml de LB suplementados con 100 µg/ml de ampicilina. Hacer crecer un cultivo nocturno a 37 ° C con agitación.

2. A la mañana siguiente, agregue 0,5 ml de cultivo durante la noche a 4,5 ml de LB con 100 µg/ml de ampicilina. Crecer 1 h a 37 ° C.

3. Extraer 1 ml de muestra no inducida. Centrifugar y quitar el sobrenadante. Congele o guárdelo en hielo hasta que esté listo para ejecutar la PÁGINA SDS.

4. Agregar IPTG a una concentración final de 1 mM y crecer durante 2-3 h.

5. Quitar 1 ml inducida por ejemplo. Centrifugar y quitar el sobrenadante. Congele o guárdelo en hielo hasta que esté listo para ejecutar la PÁGINA SDS.

6. Resuspender los gránulos de células en tampón de muestra de 200 µl de página SDS; calentar 3-5 min a 90 ° C.

7. Analice 5-10 µl utilizando la PÁGINA SDS seguida de una tinción azul de Coomassie (o 1-2 µl para Western blot).

7 Las muestras cultivadas en minicultivos también se pueden utilizar para evaluar la solubilidad de una proteína de fusión en particular (véase la Nota 6 para el protocolo de expresión de minicultivo). Al final del período de inducción, coseche las células por centrifugación. Resuspender el gránulo en 200 µl de PBS frío. Lisar las células mediante sonicación; mantener la muestra en hielo. Guarde una pequeña alícuota del lisado para su análisis por SDS-PAGE. Centrifugar la muestra lisada durante 15 minutos. Retire el sobrenadante a un tubo separado. Resuspender el gránulo en 200 µl PBS. Analice parte del lisado crudo, el sobrenadante y el pellet resuspendido mediante SDS-PAGE o Western blot. Si la muestra se observa tanto en la fracción de lisado como en la de sobrenadante, la muestra es suficientemente soluble. Si la muestra está presente principalmente en el lisado y la pastilla resuspendida, lo más probable es que la muestra esté en cuerpos de oclusión. En los casos en que la proteína se encuentre en cuerpos de inclusión, explore diferentes condiciones de expresión para cambiar la expresión a una forma soluble (ver Nota 8).

8Si la proteína de fusión se expresa principalmente en cuerpos de inclusión (p. ej. > 80% insoluble), se pueden emplear varias estrategias para mejorar la solubilidad. A menudo, la inducción a una temperatura más baja (15-25 °C) es efectiva para cambiar la expresión de los cuerpos de inclusión a la fracción soluble. Las células inducidas a esta temperatura más baja crecerán más lentamente y requerirán períodos de inducción durante la noche. En algunos casos, puede ser necesario el uso de cepas de huésped alternativas o modificaciones en la construcción del plásmido. Si la proteína de fusión permanece principalmente en los cuerpos de inclusión, incluso después de intentar obtener proteína soluble, puede valer la pena aumentar la producción de E. coli y purificar suficiente proteína de la pequeña cantidad de proteína soluble que está disponible. En algunos casos, se deben explorar otras etiquetas de proteína de fusión.

9 Niveles bajos de expresión de proteínas podrían ser el resultado del uso raro de codones. En este caso, cambiar a otra cepa de E. coli que contenga transcripciones adicionales para el ARNt de codones raros puede mejorar significativamente la producción de proteínas. Diferentes formulaciones de medios o la adición de hasta un 2% de glucosa también pueden mejorar la expresión (13, 14). Si se sospecha que la proteína expresada es tóxica para las células (por lo general, dejarán de crecer después de la inducción con IPTG), intente inducirla en un momento posterior por un período de tiempo más corto. Disminuir la concentración de IPTG es otra opción que debe explorarse.

10El crecimiento celular del monitor mediante la lectura de la densidad óptica a 600 nm (A600). Un cultivo nocturno debe alcanzar un A600 ~1-1, 2. Las células deben inducirse en una fase temprana de la curva de crecimiento logarítmico para E. coli, A600 ~ 0,5 a 0,7. A 37 ° C, los cultivos tardarán aproximadamente 2 h en alcanzar una etapa de crecimiento logarítmico temprana. Si las células crecen a una temperatura más baja, se debe aumentar el tiempo de incubación, ya que las células crecerán más lentamente a temperaturas más bajas. Generalmente, el mayor rendimiento de proteína de fusión se obtendrá cuando las células se inducen a A600 = ~ 0.5. Después de la inducción con IPTG, una pauta general para el tiempo de incubación es la siguiente: 3 h a 37 °C, 5 h a 30 °C y durante la noche a 25 °C o menos. Coseche las células antes de la saturación, A600 ~ 1.0–1.2.

11Para garantizar una aireación adecuada, los matraces solo deben llenarse al 20-30% de su capacidad.

12 Es importante que no haya inhibidores de la serina proteasa en la muestra antes de la escisión con trombina o factor Xa. Los siguientes inhibidores de la proteasa deben eliminarse antes de la escisión de trombina o factor Xa: AEBSF, APMSF, antitrombina III, antipaína, α1-antitripsina, aprotinina, quimostatina, hirudina, leupeptina y PMSF. Además, la benzamidina Pefabloc TH es específica para la trombina, y la FXa Pefabloc es específica para el factor Xa. Se deben evitar los siguientes inhibidores de la proteasa con proteasa de prescripción: ZnCl2 de 100 mM, quimostatina de 100 µM y Pefabloc de 4 mm.

13hay una serie de métodos alternativos para la detección de proteínas de fusión GST. Para proteínas que se expresan bien a un alto nivel, el método más simple de monitorear la purificación es a través de geles SDS-PAGE teñidos con tinción azul o plata de Coomassie. Una alternativa para las proteínas que se expresan a niveles bajos es usar Western blotting usando un anticuerpo dirigido a GST o a la proteína diana. Una alternativa para expresiones a pequeña escala es monitorear la presencia de GST con un ensayo enzimático ELISA o CDNB.

14Save una pequeña cantidad de muestra de proteína de cada etapa de la purificación, incluidos lisis, sobrenadante, gránulos, fracciones no unidas de la carga de la muestra, pasos de lavado y pasos de elución que se analizarán mediante SDS-PAGE o Western blotting. Después de analizar y agrupar todas las muestras, deseche las fracciones no deseadas.

Las proteínas 15GST también se pueden purificar utilizando un método de purificación por lotes. Un método de purificación por lotes es rápido, fácil y requiere poco equipo; sin embargo, la proteína resultante puede contener más impurezas y tener un rendimiento menor que una purificación basada en cromatografía. Las purificaciones por lotes se utilizan mejor cuando se examinan las condiciones de purificación. La purificación de lotes que se describe a continuación generalmente se realiza a temperatura ambiente. Para minimizar el riesgo de degradación proteolítica, el procedimiento se puede realizar a 4 °C aumentando el tiempo de incubación de 2 a 4 veces.

1. Lisar células y obtener proteínas de fusión solubles (ver Notas 8 y 21 si la muestra se encuentra en cuerpos de inclusión).

2. Añadir 2 ml de matriz a granel de glutatión sefarosa al 50% de suspensión (volumen de lecho de 1 ml) por cada sobrenadante de lisado bacteriano de 100 ml. Incubar 30 min a temperatura ambiente con agitación suave.

3. Centrifugadora de 500 × g durante 5 min. Retire el sobrenadante y guárdelo para el análisis por SDS-PAGE para determinar la eficiencia de la unión.

4. Lavar la resina con 10 volúmenes de cama PBS. Resuspender suavemente y luego centrifugar 500 × g durante 5 min. Retire el sobrenadante. Repita los pasos de lavado y centrifugación para un total de 3 lavados de 10 volúmenes de lecho cada uno.

5. Elute la proteína de fusión resuspendiendo la resina con 1,0 ml de tampón de elución de glutatión por ml de volumen de lecho. Incubar 10 min a temperatura ambiente. Centrifugadora de 500 × g durante 5 min. Transfiera el sobrenadante que contiene proteína de fusión a un tubo separado. Repita los pasos de elución y recolección un total de 3 veces. Los sobrenadantes pueden agruparse o analizarse por separado mediante SDS-PAGE para controlar el contenido de proteínas (véase la nota 12).

El volumen de lecho de 16A es igual a la mitad de la suspensión al 50% de glutatión Sefarosa 4B utilizada para la purificación. Para preparar una mezcla de glutatión sefarosa al 50% (se suministra como una mezcla de ~ 75%): Determine el volumen de lecho requerido para la escala de purificación. Resuspender la glutatión Sefarosa 4B. Por cada ml de volumen de lecho requerido, pipetear 1,33 ml de la suspensión al 75% a un tubo de centrífuga de tamaño adecuado. Centrifugar a 500 × g durante 5 min. Decantar el super. Lavar con 10 volúmenes de lecho (10 ml por 1,33 ml de suspensión original) de PBS invirtiendo suavemente el tubo varias veces para mezclar, luego centrifugar 500 × g durante 5 min. Decantar el super. La falta de extracción de la solución de almacenamiento de etanol puede interferir con los pasos de unión posteriores. Añadir 1 ml de PBS por cada 1,33 ml de la mezcla original. Esto da como resultado una suspensión del 50%.

17glutatión Sefarosa tiene una capacidad de unión mínima anunciada de 8 mg/ml. Una columna de 20 ml debe ser adecuada para purificar proteínas de cultivos de E. coli de 3 × 600 ml que contengan ~ 20-40 mg de proteína de fusión por cultivo. Tanto la cantidad de resina utilizada como el tamaño de la columna se pueden escalar hacia arriba o hacia abajo dependiendo de la cantidad de proteína a purificar.

18 reSuspender el gránulo utilizando 25-50 µl de tampón de lavado por ml de cultivo original.

19la interrupción de la célula se completa cuando la suspensión se despeja parcialmente y se vuelve un color ligeramente más oscuro. Evite la espuma durante la sonicación, ya que esto puede llevar a la desnaturalización de la proteína de fusión. Evite la sobremonicación, ya que esto puede conducir a la co-purificación de las proteínas de E. coli del huésped junto con la proteína de fusión GST. La alta viscosidad debido a la liberación de ácidos nucleicos durante la sonicación se puede reducir agregando DNasa o benzoasa al tampón de lisis. Lisozima hasta una concentración de 0.se pueden añadir 2 mg/ml como ayuda para la lisis celular. Una alternativa a la sonicación es el uso de formulaciones de extracción de células disponibles comercialmente. Sin embargo, estos productos podrían contener componentes patentados que interfieren con las aplicaciones posteriores.

20Si fallan los intentos de cambiar la expresión de los cuerpos de inclusión a la fracción soluble, las proteínas de fusión de GST insolubles a veces se pueden purificar en presencia de desnaturalizantes como la urea, seguidas de un nuevo moldeado. La solubilización con detergentes como sarkosil (N-laurilsarosina) también se ha empleado con éxito (15, 16). Aunque el siguiente protocolo se ha utilizado con éxito para desnaturalizar y volver a naturalizar las proteínas de fusión GST, cada construcción de proteína de fusión es única y las condiciones exactas de desnaturalización y renaturalización deben determinarse empíricamente. Los desnaturalizantes comunes que se han empleado con éxito incluyen guanidina HCl, urea, Tween 20, CTAB y SDS (17, 18). Los desnaturalizantes deben eliminarse por completo para permitir el reenfoldeo adecuado de la proteína. Las condiciones que deben optimizarse para facilitar el reenfoque incluyen:: tipo de desnaturalizante, pH, presencia de agente reductor, velocidad de eliminación de desnaturalizante y concentración de proteínas. Una vez que la proteína haya sido re-naturalizada, verifique que la proteína haya recuperado su conformación y función nativas y elimine cualquier proteína doblada incorrectamente.

1. preequilibrar la columna de glutatión Sefarosa; sonicar las células de E. coli peletizadas y separar el sobrenadante de lisado y las fracciones de gránulos por centrifugación (véase 3.3 Purificación de afinidad de las etapas 1 a 8 de la proteína de fusión GST). Resuspenda el gránulo de lisado que incluye los cuerpos de inclusión, en un tampón de lavado de 15 ml. Centrifugar 20 min a 48.000 × g (4 °C). Decantar el sobrenadante y resuspender el gránulo lavado en 12 ml de tampón en U (resuspender en 20 µl de tampón en U por ml de cultivo original). Incubar 2 h en hielo.

2. Centrifugar 20 min a 48.000 × g (4 °C). Transfiera el sobrenadante que contiene la proteína de fusión desnaturalizada a un tubo de centrífuga limpio.

3. Añadir Triton X-100 al sobrenadante hasta una concentración final del 1%.

4. Dializar la muestra en PBS / glicerol durante 2-3 h. El volumen del tampón de diálisis debe ser un mínimo de 20 veces el volumen de la muestra.

5. Dializar la muestra durante la noche versus PBS con inhibidores de proteasa utilizando un volumen tampón que es > 100 veces el volumen de muestra.

6. Retirar la muestra de la diálisis y centrifugar 20 minutos a 4.000 × g.

7. La proteína extraída y re-naturalada de los cuerpos de inclusión ahora se puede aplicar a las columnas de glutatión Sefarosa y purificarse.

Soluciones:

Tampón de lavado: 50 mm Tris, 5 mM EDTA, 1 µg/ml leupeptin, 1 µg/ml pepstatina, 0,15 mm PMSF, pH 8,0

Tampón en U: 5 M de urea, 50 mM Tris, 5 mM EDTA,5 mM 2-ME, 1 µg/ml leupeptin, 1 µg/ml pepstatina, 0,15 mM PMSF, 1 mM DFP pH 8,0

PBS/glicerol: 1X PBS, 20% de glicerol, 1% Triton X-100, 5 mM 2-ME, 5 mM EDTA, 5 mM 2 – ME, 1 µg/ml de leupeptina, 1 µg/ml de pepstatina, 0,15 mM PMSF, 1 mM DFP pH 7,4

21 Se recomienda el uso de una bomba peristáltica para controlar uniformemente los caudales. Si se produce compresión de la resina, la presión es demasiado alta y el caudal debe reducirse.

22la cinética de unión entre glutatión y GST es relativamente lenta. Por lo tanto, es importante utilizar caudales bajos para lograr la máxima capacidad de unión, por ejemplo, 0,1 ml / min para una columna de identificación de 2,5 cm. El uso de caudales demasiado rápidos puede disminuir la cantidad de proteína de fusión unida debido a la lenta cinética de asociación. Los pasos de lavado y elución se pueden realizar a caudales más rápidos para ahorrar tiempo (1,5 ml/min y 0,3 ml/min, respectivamente). Para muestras de gran volumen, el encuadernado se realiza más cómodamente durante la noche, con ajustes en los caudales para que la columna no se seque.

23 El análisis de las fracciones no unidas indicará si la proteína de fusión se une o no. Si la proteína no se detecta en fracciones tempranas, sino que aparece en fracciones posteriores, indica que se ha excedido la capacidad de la columna. La reducción de la carga de proteínas o el aumento del tamaño de la columna aliviarán esta condición.

24Si la proteína de fusión se une mal a la glutatión Sefarosa, hay varias alternativas para intentar aumentar la eficiencia de unión. Prueba un método de lisis más suave. Si el método utilizado es demasiado duro, la proteína puede desnaturalizarse y, por lo tanto, no puede unirse a la columna. Además, si se vuelve a naturalizar la proteína de los cuerpos de inclusión, asegúrese de que todos los desnaturalizantes se hayan eliminado del tampón, ya sea mediante diálisis exhaustiva o mediante la aplicación de la muestra a una columna de desalación, antes de aplicarla a la columna de glutatión. Retire la solución de almacenamiento de etanol de la sefarosa de glutatión; reduzca la columna con tampón de glutatión fresco seguido de un lavado con PBS inmediatamente antes de cargar la muestra. Aumentar la cantidad de resina y/o disminuir el caudal utilizado para cargar la muestra. Intente agregar TDT de 1 a 20 mM a la muestra. Si el problema persiste, limpie la columna de acuerdo con la recomendación del fabricante. Si aún no se restaura la unión, intente usar resina fresca.

25el rendimiento de la proteína de fusión también se puede estimar midiendo la absorbancia a 280 nm (A280). El coeficiente de extinción para la mitad GST por sí sola es ~ 1.5, es decir, 1.00 A280 = ~ 0.6 mg/ml de proteína, aunque el coeficiente de extinción de la proteína de fusión dependerá parcialmente de las características de absorbancia de la proteína diana.

26Si hay un problema para elutar la proteína de la columna de sefarosa de glutatión, intente disminuir el caudal y aumentar el volumen de tampón de elución que se utiliza. Asegúrese de usar tampón de glutatión reducido fresco (hágalo el día en que se usará). Aumente la concentración de glutatión hasta 40 mm y/o aumente el pH del tampón a pH 8,0–9,0. Añadir 1-20 mm de TDT (u otro agente reductor) al tampón. La adición de un detergente no iónico también puede mejorar la solubilización y minimizar cualquier agregación que pueda estar ocurriendo.

27la contaminación de la proteína de fusión purificada con proteínas de células huésped de E. coli es una indicación de que la sonicación ha sido demasiado severa. Si hay fragmentos degradados de la proteína de fusión, intente agregar inhibidores de proteasa adicionales al tampón de lisis. Mantenga todas las muestras, tampones y tubos de recolección fríos para minimizar la proteólisis. Si la degradación se produce durante la expresión de proteínas, intente inducir la muestra tarde (~0.8 OD600) y disminuir la duración del período de inducción. Cambiar a una cepa huésped alternativa también puede ayudar.

28una alternativa a la digestión en solución es la escisión de proteasa de la proteína de fusión mientras se une a la matriz de glutatión Sefarosa. La proteína de fusión se extrae y se carga en la glutatión Sefarosa, seguida de un lavado con PBS (ver Purificación de afinidad de la proteína de fusión GST, pasos 1-11). En lugar de eluir la proteína con tampón de glutatión, se carga una solución de PBS que contiene la enzima en la columna y se incuba durante varias horas a temperatura ambiente (4 °C para la proteasa de prescripción). La proteína escindida luego se lava de la columna con varios volúmenes de PBS en la columna. La proteína de fusión residual y la fracción GST se pueden eliminar de la columna lavando la columna con un tampón de glutatión reducido. La cantidad de enzimas y el tiempo de incubación deben determinarse empíricamente para cada proteína de fusión. Analice todas las muestras por SDS-PAGE para determinar la eficiencia de la escisión y la pureza de la proteína.

29en una escisión de proteasa en modo lote, añadir una cantidad determinada empíricamente de enzima a la proteína de fusión unida a la resina (véase la nota 15 a–d). Use 1 ml de enzima que contiene PBS por ml de volumen de lecho. Incubar a temperatura ambiente durante varias horas con agitación suave. Centrifugar 500 × g durante 5 min para sedimentar la resina. Retire el super que contiene la proteína diana en un tubo separado. Lave la glutatión Sefarosa con PBS hasta 3 veces para recuperar la proteína de fusión hendida. Incubar la resina con tampón de glutatión para eliminar el GST y la proteína de fusión residual. Utilice 1 ml de tampón de glutatión por ml de resina. Centrifugar 500 × g y recuperar GST eluido. Repetir hasta 3 veces. Analice muestras por PÁGINA SDS.

30Si se utiliza la proteasa de trombina, la digestión se puede llevar a cabo en el tampón de glutatión utilizado para eluir la proteína de la columna. Si se utiliza el factor Xa, se recomienda dializar la proteína en un tampón Tris o un tampón PBS antes de la digestión; el glutatión presente en el tampón de elución puede interrumpir los puentes de disulfuro presentes en el factor Xa, lo que lleva a una digestión ineficiente de la proteína de fusión. Una determinación empírica de las condiciones de digestión para cada proteína de fusión debe determinarse en un experimento piloto de digestión. Un método conveniente es digerir 100 µg de proteína de fusión en un rango de proporciones enzima-sustrato y variar el tiempo de incubación. Los tiempos de incubación típicos varían de 2 a 8 horas. Las relaciones enzima-sustrato recomendadas para la trombina son 1:100, 1:350, 1:1000, y 1:3000 (unidades de enzima por µg de proteína de fusión), y para el factor Xa son 1:10, 1:25, 1:50, 1:100, 1:300 (µg de enzima por µg de proteína de fusión). En los momentos deseados, retire 2 µg de proteína y detenga la digestión agregando la alícuota de la muestra al tampón de muestra SDS hirviendo. Analice las muestras por SDS-PAGE para determinar las condiciones óptimas de escisión. Además de la relación enzima-sustrato y el tiempo, considere la posibilidad de alterar las condiciones del tampón, como aumentar o disminuir la concentración de NaCl o agregar Ca2+ al tampón (consulte la Nota 31 para obtener consejos de solución de problemas).

31Si se observan múltiples bandas en la PÁGINA SDS para la proteína diana después de la digestión, verifique la secuencia de proteínas diana para detectar posibles sitios de reconocimiento de proteasas secundarias. Si existen sitios de escisión secundarios, vuelva a clonar en un vector diferente. Si no se observa escisión, verifique la secuencia de ADN para verificar la presencia e integridad del lugar de escisión de proteasa esperado. Asegúrese de que los inhibidores de la proteasa se han eliminado por completo del tampón. Agregue más enzimas y / o aumente los tiempos de incubación a la noche a la mañana. Si la digestión permanece incompleta en las proporciones más altas de enzima a sustrato y en los puntos de tiempo más largos, considere la reingeniería del sitio de escisión de la proteasa para incluir varias glicina entre la fracción GST y la proteína diana para disminuir la probabilidad de que un obstáculo estérico interfiera con la escisión (19, 20).

32Si no es deseable la inhibición de la enzima una vez finalizada la digestión utilizando inhibidores de la serina proteasa, la muestra se puede aplicar a una columna de benzamidina HiTrap para eliminar la enzima de la muestra.

33Si la muestra debe ser recromatografiada en la columna de glutatión Sefarosa para eliminar el GST y cualquier proteína de fusión no digerida, es fundamental que el glutatión reducido se elimine completamente de la muestra. El glutatión se equilibra muy lentamente a través de las membranas de diálisis; por lo tanto, si se utilizan tubos de diálisis con un MWCO <12.000, pueden ser necesarios 3 o más cambios de tampón para la eliminación completa. También se puede requerir un mayor tiempo de diálisis (durante la noche) y un mayor volumen de tampón para grandes volúmenes de muestra.

34 La misma columna de sefarosa de glutatión puede utilizarse tanto para el aislamiento inicial de la proteína de fusión como para la repurificación después de la escisión enzimática. Se recomienda dedicar una sola columna a una construcción proteica individual para evitar la posible contaminación cruzada de diferentes proteínas recombinantes. Las columnas pueden reutilizarse varias veces. Si la eficiencia de encuadernación disminuye con el tiempo, limpie la columna de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Si la actividad de enlace no se restaura, se debe usar una nueva columna.

35la unión máxima se produce si la columna está completamente reducida; sin embargo, si la columna de glutatión sefarosa se ha lavado menos de 48 h antes de este paso, este paso puede omitirse.

36la proteína diana estará en la fracción no unida y el GST y cualquier proteína de fusión no escindida se unirán a la columna.

37 Se recomiendan pequeños volúmenes de muestra para una buena resolución de la proteína diana frente a otros contaminantes. Si no es posible concentrar la muestra en un volumen pequeño, se pueden realizar varias inyecciones de la muestra.