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El CPV-2 es el principal agente etiológico de la gastroenteritis viral en perros. Es un miembro de la familia Parvoviridae, perteneciente al género Protoparvovirus y a la especie Protoparvovirus tipo 1. Es un virus sin envoltura con un genoma de ADN de una sola cadena, que codifica para dos proteínas de la cápside, VP1 y VP2, necesarias para el ensamblaje y empaquetado del genoma viral, así como para las proteínas no estructurales NS1 y NS2, que ayudan a controlar la replicación del ADN, el ensamblaje y la regulación de la expresión de genes .

En los últimos años, el CPV-2 ha desarrollado nuevas variantes antigénicas. En 1980, la cepa original de CPV-2 fue reemplazada por la variante designada tipo 2a (CPV-2a), en 1984 , se identificó CPV-2b, y en 2001, se detectó y notificó CPV-2c en Italia. La última variante también se ha identificado en Asia, África y América. Debido a la existencia de múltiples variantes antigénicas para CPV-2, los signos clínicos pueden variar en gran medida .Posteriormente, los veterinarios tienen menos certeza a la hora de emitir su diagnóstico presunto, y por lo general, se requieren algunas pruebas de laboratorio para confirmar su diagnóstico; aunque se han desarrollado varias técnicas en laboratorios de investigación, como los ensayos de hemaglutinación, la inmunofluorescencia, ELISA,PCR, prueba de inmunocromatografía y cultivo celular (entre otras), en realidad las técnicas con mayor disponibilidad dentro de los laboratorios clínicos en hospitales veterinarios solo son la prueba de inmunocromatografía y la PCR, sin embargo, en la investigación sobre la sensibilidad y especificidad de estos procedimientos, los informes son controvertidos.Además, en pacientes con diferentes grados de gravedad de la enfermedad, la sensibilidad y especificidad de estas técnicas no se han estudiado ampliamente.

El objetivo de este estudio es reportar las ventajas y desventajas que ofrece la prueba inmunocromatográfica y la PCR para el diagnóstico de pacientes que presentan una amplia diversidad de signos clínicos para CPV-2.

Este estudio se realizó de acuerdo con las directrices de la Norma Oficial Mexicana de Investigación en Animales Experimentales NOM-062-ZOO-1999.

Los perros con enteritis clínica hospitalizados en el Hospital Veterinario para Pequeños Animales de la Universidad Autónoma de Estado de México, fueron examinados para este estudio y seleccionados en base a CPV-2 positivo o negativo probado mediante PCR anidada (nPCR). Como resultado, se seleccionaron 45 perros que dieron positivo y se incluyeron 5 perros de prueba negativa como controles. Los 50 perros fueron examinados clínicamente por tres veterinarios simultáneamente para obtener sensibilidad al diagnóstico clínico. Cada veterinario emitió su diagnóstico presuntivo de manera discreta, utilizando el registro médico veterinario orientado a problemas (POVMR) como su herramienta de diagnóstico.

A continuación, se analizaron muestras fecales de todos los perros mediante PCR e inmunocromatografía, mientras que se utilizaron muestras de sangre para realizar un hemograma completo.

La nPCR se considera una técnica altamente confiable y sensible para identificar partículas virales del CPV-2 , por lo que, en este estudio, la sensibilidad de las pruebas utilizadas se correlacionó con las obtenidas previamente de la nPCR, para el diagnóstico de CPV-2.

Las muestras de heces de perro se obtuvieron con hisopos rectales, que se suspendieron en agua libre de nucleasas y 200 µl de los homogeneizados, y se utilizaron para extracción de ADNn. El procedimiento se realizó utilizando el kit de extracción de ADN de heces de ADN QIAamp® (QIAGEN, Mainz, Alemania), siguiendo las instrucciones del fabricante. Las muestras de AllDNA se cuantificaron utilizando un espectrofotómetro Quawell Q5000 (Quawell Technology, Inc., San Jose, CA, U. S. A.). se utilizaron 100 ng de ADN de cada muestra para reacciones de PCR con 50 µl de volumen final. Anteriormente, se diseñó un par de cebadores en nuestro laboratorio para amplificar un fragmento de 275 pb,ParvoInt2FB (5′-TCAAGCAGATGGTGATCCAAG-3′) y ParvoInt2CR (5′-GGTACATTATTAATGCAGTTA-3′) ubicados en los nucleótidos 1,107–1,130 y 1,360–1,382 del gen VP2 (número de acceso al banco de genes FJ0051962c).

Las reacciones de PCR se realizaron utilizando 2 µl de cada imprimación (200 nM), 12,5 µl de GoTaq® Green Master Mix (Promega, Madison,WI, EE.UU.) que contenía ADN polimerasa, tampón de reacción (pH 8,5) y 400 µM de cada nucleótido (dATP, dGTP, Dctp y dTTP); 3 mm de MgCl2.y 28.5 µl de agua libre de nucleasas. Todas las reacciones se llevaron a cabo en las siguientes condiciones de amplificación: 1 ciclo a 94°C durante 5 min para desnaturalización inicial, seguido de 35 ciclos a 94°C durante 30 seg, 52°C durante 1 min, 72°C durante 1 min y un ciclo de extensión final a 72°C durante 5 min.

El nPCR se realizó inicialmente amplificando un fragmento de 1,740 bp utilizando cebadores ParvoExt1f (5′-ATGAGTGATGGAGCAGTTCA-3′) y ParvoExt3R (5′-AGGTGCTAGTTGAGATTTTTTCATATAC-3′), y se diseñaron utilizando las secuencias de nucleótidos 1-20 y 1,712–1,740 del gen VP2 para caninos parvovirus (número de acceso al GenBank FJ0051962c). La reacción se estandarizó a un volumen final de 50 µl.

La mezcla de reacción contenía 1 µl de GoTaq ® Flexi DNA Polimerasa 5 U / µl (Promega), 5 µl de GoTaq® Flexi buffer 5XGreen, 3 µl de MgCl2 de 25 mM, 4 µl de dNTP de 200 µM, 2 µl de cebadores, 10 µl de ADN con una concentración final de 100 ng y 23 µl de agua libre de nucleasas. La reacción se llevó a cabo en las siguientes condiciones de amplificación: 1 ciclo a 94°C durante 5 minutos, seguido de 35 ciclos a 94°C durante 30 segundos, 50°C durante 45 segundos, 72°C durante 1 minuto y 1 ciclo a 72°C durante 5 minutos. Posteriormente, se utilizó 1 µl del producto de esta reacción como plantilla de ADN para el procedimiento de anidación, y las condiciones de imprimación y amplificación fueron las mismas para el fragmento de 275 pb.

Todos los productos de amplificación se identificaron mediante electroforesis horizontal en geles de agarosa al 2% teñidos con 0,5 µg/ml de bromuro de etidio y visualizados con un transiluminador UV.

Para el análisis de la prueba de inmunocromatografía para parvovirus canino (CPV Ag), el kit ANIGEN® (Bionote Inc., Gyeonggi-do, Corea). Cada prueba se llevó a cabo siguiendo las instrucciones del fabricante.

Se tomaron muestras de sangre de la vena yugular utilizando tubos vacutainer con EDTA como anticoagulante. Los recuentos completos de células sanguíneas (CBC) se realizaron utilizando un contador de células anautomadas (QBC vet-IDEXX Laboratories, Inc., Westbrook, ME, U. S. A.). Las películas de sangre fueron teñidas con Wright-Giemsa y examinadas bajo un microscopio fotónico. Se consideró leucopenia cuando el recuento total de leucocitos era inferior a 6 × 103 / µl .

El análisis de resultados se realizó mediante el uso de una matriz para variables codificadas , y se crearon tablas de contingencia para determinar las propiedades de la prueba diagnóstica . Además, se determinó el estadístico Kappa para estimar la concordancia entre las tres pruebas utilizadas y el nPCR. El valor de kappa se caracterizó de acuerdo con Kantere y colegas en 2015, donde el valor de Kappa 1 indica concordancia absoluta, mientras que un valor de 0 indica que la concordancia ocurre debido al azar. En general, los valores Kappa superiores a 0,6 indican un buen nivel de concordancia; el análisis se realizó utilizando el paquete estadístico SPSS Ver. 22.0 (IBM, Inc., Armonk, NY, U. S. A.).

Noventa y un punto uno (91,1) % de los perros positivos para CPV-2 por nPCR fueron de raza pura; 95.el 5% de los pacientes tenían entre dos y ocho meses de edad, y el 4,5% tenían más de un año de edad. En cuanto a su estado de vacunación, el 40% se vacunó al menos una vez para prevenir la infección por CPV-2.

La frecuencia de signos clínicos mostrados por estos perros fue la siguiente: el 44,4% presentó vómitos y diarrea; el 20% presentó fiebre, vómitos y diarrea(catarrales o hemorrágicos); el 17,7% presentó solo diarrea; el 8,8% presentó solo vómitos; y el 4,4% presentó diarrea y fiebre, y el 4,4% presentó vómitos y fiebre.Se observó leucopenia en el 48,8% de los perros (Tabla 1).

Mediante el examen clínico, los veterinarios diagnosticaron solo el 57,8% de los pacientes positivos a CPV–2 y el 100% de los perros negativos; por lo tanto, el valor de sensibilidad para el diagnóstico clínico se estimó en el 57,7% (IC0, 95 42,2–72), y la especificidad observada fue del 100% (IC0, 95 46,2-98,8).

En cuanto al diagnóstico de las pruebas de laboratorio, de 100% de los perros que resultaron positivos a través de nPCR, solo 30/45 de estos pacientes fueron positivos a CPV-2 a través de la prueba de inmunocromatografía, mientras que los cinco pacientes de control que dieron negativo a CPV-2 fueron diagnosticados correctamente. Por lo tanto, esta técnica mostró una sensibilidad del 66,6% (IC0, 95 50,9–79,5), y la especificidad observada fue del 100% (IC0, 95 46,2–98,8).

Utilizando la técnica de PCR, 36/45 pacientes fueron positivos a CPV-2, y los cinco pacientes control fueron confirmados negativos a lo largo de la nPCR. Así, la PCR demostró una sensibilidad del 80% (IC0, 95 63,1-87,7) y una especificidad del 100% (IC0, 95 67,8–99,1) (Fig. 1).

La concordancia entre las tres técnicas se demuestra a través del valor Kappa (Tabla 2).

La gastroenteritis causada por CPV-2 se considera una de las principales enfermedades virales que afectan a los perros. Aunque los signos clínicos de infección por parvovirus canino pueden variar, los signos más comunes reportados fueron: anorexia, depresión, letargo ,fiebre, diarrea mucoide y hemorrágica y leucopenia ; en casos subclínicos, algunos de estos signos pueden o no estar presentes .

Durante el examen clínico, se observó variabilidad en las manifestaciones clínicas de la infección. Solo el 20% de los perros estudiados presentaron signos típicos como los descritos comúnmente en la literatura. La variabilidad clínica de esta enfermedad se ha descrito anteriormente , y algunos autores han discutido factores como la edad, el estado inmunitario, la vía de exposición, la dosis viral, la virulencia de las cepas y la coinfección con otros agentes infecciosos como posibles causas . Esto complica la obtención de un diagnóstico preciso de CPV-2 cuando los veterinarios confían únicamente en su examen clínico. Por lo tanto, con respecto a nuestra investigación basada únicamente en este procedimiento, el 42,2% de los perros tendrán un diagnóstico falso negativo de CPV-2.A través de las historias clínicas de los perros en este estudio, observamos que los veterinarios descartaban la posibilidad de infección principalmente porque los perros no exhibían los signos clínicos clásicos descritos en la literatura, habían sido vacunados contra CPV-2 y/o eran adultos. Sin embargo, la mayoría de los perros en nuestro estudio mostraron signos atípicos. Por lo tanto, creemos que las infecciones subclínicas de CPV-2 son más comunes, y los veterinarios, que deben decidir si usar o no pruebas diagnósticas adicionales con alta sensibilidad y especificidad, deben considerar cuidadosamente estos hallazgos.

En este estudio, el 40% de los pacientes positivos a CVP-2 habían sido inmunizados previamente. Es bien sabido que la técnica de PCR es altamente sensible y, por lo tanto, detecta partículas virales de vacuna en las heces de pacientes recientemente vacunados; los estudios indican que es posible obtener resultados falsos positivos de los días 3 a 10 después de la vacunación con una vacuna viva modificada de CPV . En consecuencia, para realizar este estudio, se excluyó a los pacientes con antecedentes de vacunación en los 15 días previos. Además, se secuenciaron muestras de perros vacunados positivos a CPV-2, y en todos los casos estudiados se identificó el genovariante CPV-2c (datos no mostrados), lo que implica que los perros estaban infectados con CPV-2c de campo, sabiendo que aún no se dispone de CPV-2c en México. Además, en México, Pedroza y colegas informaron que la variante antigénica más común en perros infectados era CPV-2c .

Por otro lado, muchos veterinarios consideran la presencia de leucopenia, un factor de apoyo para el diagnóstico de CPV-2. Sin embargo, observamos que solo 48.el 8% (22/45) de los perros estudiados presentaron leucopenia durante la evaluación, lo que es consistente con otros informes que indicaron que alrededor del 50% de los perros no presentaban alteraciones hematológicas en el momento de la evaluación . Por lo tanto, un CBC es una herramienta valiosa que puede proporcionar información sobre la gravedad de la enfermedad, sugiriendo un pronóstico y determinando la respuesta al tratamiento. Sin embargo,la leucopenia no debe considerarse como una herramienta de diagnóstico para el CPV-2, ya que no proporciona evidencia de la presencia del virus.

Se utilizan varias técnicas de identificación viral para la confirmación definitiva de la infección por CPV-2, por ejemplo, las pruebas rápidas basadas en inmunocromatografía son ampliamente utilizadas por los médicos, porque el procedimiento es fácil, rápido y accesible. Además, no requiere preparación de muestras ni envío a un laboratorio especializado para su análisis. La sensibilidad variable de esta prueba es su desventaja; varios estudios han indicado que su sensibilidad varía de 50 a 100% , y en nuestro estudio, la sensibilidad comparativa con nPCR fue de 66,6%. Algunos estudios han sugerido que la baja sensibilidad de la técnica se debe a la necesidad de que grandes cantidades de partículas virales se viertan en las heces de los perros para obtener un diagnóstico positivo . El uso de esta técnica debe ser reconsiderado, ya que se espera una mayor probabilidad de resultados falsos negativos. Para evitar esto, se deben utilizar otras técnicas, con sensibilidades más altas .

Varios estudios han demostrado la alta sensibilidad de las pruebas basadas en PCR; actualmente, hay múltiples variantes del mismo procedimiento que ofrecen rangos de sensibilidad del 80 al 100% . En el presente estudio, la PCR tuvo una sensibilidad del 80%, y es de destacar que los pacientes solo fueron identificados como positivos a la infección a través de nPCR, mientras que ni la PCR ni las pruebas de inmunocromatografía fueron capaces de identificarlo.

En cuanto al valor kappa, comparamos los resultados entre los tres métodos analizados con el nPCR. Sin embargo, se demostró la mala concordancia entre el diagnóstico clínico y la nPCR; se observó una concordancia moderada entre la PCR convencional y la nPCR, lo que puede deberse a la similitud entre las dos pruebas.

En cuanto a los signos clínicos, se observó la presencia de vómitos o diarrea en todos los pacientes infectados por virus, mientras que otros signos clínicos no se consideraron relevantes para la infección; de acuerdo con los signos clínicos y la sensibilidad de las técnicas utilizadas, no se observó relación alguna. Por ejemplo, el caso no.26 solo mostró vómitos como signo clínico, y se consideró negativo para CPV-2 por diagnóstico clínico veterinario, sin embargo, la prueba de inmunocromatografía, PCR y NPCRT fueron positivos para CPV-2. Además, los casos 41 y 42 en los que el principal signo clínico era la diarrea, solo pudieron ser diagnosticados con CPV-2 con nPCR.

Nuestros datos indican que las pruebas diagnósticas más utilizadas en laboratorios clínicos y veterinarios de diagnóstico para detectar el CPV-2 son altamente específicas, pero de escasa sensibilidad, lo que impide el diagnóstico preciso del CPV-2. En nuestro estudio, la PCR y la prueba de inmunocromatografía no fueron tan sensibles como la nPCR, que se confirmó en investigaciones anteriores , sin embargo, el uso de la nPCR como prueba de diagnóstico aún no está muy extendido en los hospitales veterinarios,mientras que sigue siendo ampliamente utilizado con fines de investigación.

Por otro lado, la PCR en tiempo Real, que también es altamente sensible, rara vez se usa, debido a sus altos costos de equipo y la necesidad de un personal altamente especializado para su manejo. Sin embargo, los avances tecnológicos permitieron que estas técnicas fueran más baratas y fáciles de usar, lo que podría llevar a su aplicación directa en hospitales veterinarios para mejorar la precisión diagnóstica del CPV-2.