La secuenciación N-terminal, a menudo conocida como secuenciación de Edman o degradación de Edman, es una técnica importante en el estudio de proteínas y sigue siendo un enfoque único que puede producir nuevos datos de secuencias de proteínas. También es la técnica preferida para la confirmación rápida de la expresión de proteínas.
La química de este enfoque fue introducida por primera vez en 1950 por P. Edman de la Universidad de Lund en Suecia y desarrollada durante su trabajo en Melbourne, Australia, a lo que se cree que es el primer dispositivo de secuenciación de péptidos automatizado.
Química de Edman
Fig 1. Química de degradación Edman para secuenciación de proteínas N-terminales.
Las reacciones químicas que producen el aminoácido etiquetado hidrolizado N-terminal se muestran en la figura 1. Cada ciclo incluye esencialmente 3 pasos:
- Acoplamiento del fenilisotiocianato (PITC, reactivo Edman) a la alfa-amina de la cadena polipeptídica en condiciones básicas para formar una fracción feniltiocarbamílica (PTC).
- La escisión en condiciones ácidas suaves genera un terminal amino libre en el polipéptido y un aminoácido aducido de anilinotiazolinona (ATZ).
- Este último se extrae y se convierte en un derivado de feniltiohidantoína (PTH) más estable.
El residuo de PTH resultante se analiza por HPLC y tiempos de retención en comparación con el de los aminoácidos de PTH estándar.
Reacciones secundarias y subproductos
La química y el trabajo del ciclo de secuenciación están bien controlados y producen especies perfectamente definidas, hay algunos subproductos que se detectan durante el análisis.
Como se muestra en la figura 2, provienen principalmente de hidrólisis y metanólisis de PITC durante el ciclo e incluyen difeniltiourea (DPTU), N-fenilo,O-metil-tiocarbonato (PMTC) y difenilurea (DPU), subproductos que coextractan y coeluyen con aminoácidos de PTH.
