Purification des protéinesmodifier
Les étiquettes de polyhistidine sont souvent utilisées pour la purification d’affinité de protéines recombinantes marquées par la polyhistidine exprimées dans Escherichia coli et d’autres systèmes d’expression procaryotes. Les cellules bactériennes sont récoltées par centrifugation et la pastille cellulaire résultante lysée soit par des moyens physiques, soit au moyen de détergents et d’enzymes tels que le lysozyme ou toute combinaison de ceux-ci. À ce stade, le lysat brut contient la protéine recombinante parmi de nombreuses autres protéines provenant de l’hôte bactérien. Ce mélange est incubé avec une résine d’affinité contenant des ions nickel ou cobalt divalents liés, disponibles commercialement dans différentes variétés. Le nickel et le cobalt ont des propriétés similaires et sont des métaux de transition de période 4 adjacents (v. triade de fer). Ces résines sont généralement sépharose/agarose fonctionnalisées par un chélateur, tel que l’acide iminodiacétique (Ni-IDA) et l’acide nitrilotriacétique (Ni-NTA) pour le nickel et l’aspartate de carboxyl-méthyle (Co-CMA) pour le cobalt, que la balise polyhistidine lie avec une affinité micromolaire. Ernst Hochuli et coll. couplé en 1987 le ligand NTA et les ions Nickel à des billes d’agarose. La résine est ensuite lavée avec du tampon phosphate pour éliminer les protéines qui n’interagissent pas spécifiquement avec l’ion cobalt ou nickel. Avec les méthodes à base de Ni, l’efficacité du lavage peut être améliorée par l’ajout d’imidazole de 20 mM (les protéines sont généralement éluées avec de l’imidazole de 150 à 300 mm). Généralement, les résines à base de nickel ont une capacité de liaison plus élevée, tandis que les résines à base de cobalt offrent la plus grande pureté. La pureté et la quantité de protéines peuvent être évaluées par SDS-PAGE et Western blot.
La purification par affinité à l’aide d’une étiquette polyhistidine donne généralement une protéine relativement pure lorsque la protéine recombinante est exprimée dans des organismes procaryotes. Selon les applications en aval, y compris la purification de complexes protéiques pour étudier les interactions protéiques, la purification à partir d’organismes supérieurs tels que les levures ou d’autres eucaryotes peut nécessiter une purification par affinité en tandem à l’aide de deux étiquettes pour obtenir une pureté plus élevée. Alternativement, la purification en une seule étape utilisant des ions cobalt immobilisés plutôt que des ions nickel donne généralement une augmentation substantielle de la pureté et nécessite des concentrations d’imidazole plus faibles pour l’élution de la protéine marquée par his.
Le marquage à la polyhistidine est l’option de choix pour purifier les protéines recombinantes dans des conditions dénaturantes car son mode d’action ne dépend que de la structure primaire des protéines. Par exemple, même lorsqu’une protéine recombinante est exprimée de force en E. coli produit un corps d’inclusion et ne peut pas être obtenu sous forme de protéine soluble, il peut être purifié par dénaturation avec de l’urée ou du chlorhydrate de guanidine. Généralement, pour ce type de technique, la liaison à l’histidine est titrée en utilisant le pH au lieu de la liaison à l’imidazole — à un pH élevé, l’histidine se lie au nickel ou au cobalt, mais à un pH faible (~ 6 pour le cobalt et ~ 4 pour le nickel), l’histidine se protonne et est concurrencée par l’ion métallique. Comparez cela à la purification des anticorps et à la purification de la TPS, une condition préalable à laquelle est le repliement approprié (natif) des protéines impliquées. D’autre part, on dit que l’étiquette His a tendance à s’agréger et à s’insolubiliser plus que les autres étiquettes d’affinité.
Les colonnes d’étiquettes à polyhistidine retiennent plusieurs protéines bien connues sous forme d’impuretés. L’un d’eux est l’isomérase peptidyl prolyl de type FKBP, qui apparaît autour de 25kDa (SlyD). Les impuretés sont généralement éliminées par une technique chromatographique secondaire ou par expression de la protéine recombinante dans une souche d’E. coli déficiente en SlyD. Alternativement, en comparaison avec les résines à base de nickel, les résines à base de cobalt ont moins d’affinité avec SlyD d’E. coli, mais dans plusieurs cas, elles sont modérément utiles.
Séparation d’une étiquette polyhistidine de deux étiquettes
Les protéines avec un nombre différent d’étiquettes polyhistidine éluent différemment de la résine d’affinité nickel. Pour les protéines avec une seule étiquette hexahistidine, l’imidazole de 75 mM permet l’élution à partir de Ni-NTA, tandis que pour les protéines avec deux étiquettes hexahistidine, l’imidazole de 100 mM est requis pour l’élution. Cette élution par étapes peut être utilisée pour isoler des assemblages protéiques spécifiques d’un mélange, tels que des hétéromultimères définis (par example un hétérodimère AB à partir d’un mélange comprenant des homodimères AA et BB, si seule la sous-unité B possède une étiquette polyhistidine). Une telle approche a été utilisée isolément de la streptavidine monovalente.
Tests de liancedit
Le marquage à la polyhistidine peut être utilisé pour détecter les interactions protéine-protéine de la même manière qu’un test déroulant. Cependant, cette technique est généralement considérée comme moins sensible, et également limitée par certains des aspects les plus difficiles de cette technique. Par exemple, les conditions réductrices ne peuvent pas être utilisées, l’EDTA et de nombreux types de détergents ne peuvent pas être utilisés. Les progrès récents de l’interférométrie à double polarisation se prêtent à l’EDTA et à une utilisation plus large des réactifs, et l’utilisation de telles balises spécifiques au site simplifie grandement la mesure directe du changement conformationnel associé.
Étiquettes fluorescentesdit
Des étiquettes hexahistadine CyDye ont également été développées. Ceux-ci utilisent la coordination covalente du nickel avec les groupes EDTA attachés aux fluorophores afin de créer des colorants qui se fixent à l’étiquette polyhistidine. Cette technique s’est avérée efficace pour suivre la migration et le trafic des protéines. Il y a également eu des découvertes récentes qui montrent que cette technique peut être efficace pour mesurer la distance via le transfert d’énergie de résonance fluorescente.
Étiquettes de fluorohistidine
Une étiquette de polyfluorohistidine a été rapportée pour une utilisation dans des systèmes de traduction in vitro. Dans ce système, un code génétique élargi est utilisé dans lequel l’histidine est remplacée par la 4-fluorohistidine. L’analogue fluoré est incorporé dans des peptides via la spécificité de substrat détendue de l’histidine-ARNt ligase et abaisse le pKa global du tag. Ceci permet l’enrichissement sélectif de peptides marqués à la polyfluorohistidine en présence de mélanges complexes de marqueurs traditionnels à la polyhistidine en modifiant le pH des tampons de lavage.
