Brève introduction: Techniques de transfert
Le transfert est utilisé en biologie moléculaire pour l’identification des protéines et des acides nucléiques et est largement utilisé à des fins de diagnostic. Cette technique immobilise la molécule d’intérêt sur un support, qui est une membrane nitrocellulosique ou nylon. Il utilise des techniques d’hybridation pour l’identification des acides nucléiques et des gènes spécifiques.
La technique de buvardage est un outil utilisé dans l’identification de biomolécules telles que l’ADN ad, l’ARNm et les protéines au cours des différentes étapes de l’expression des gènes. La synthèse protéique implique l’expression d’un segment d’ADN qui est converti en ARNm pour produire la protéine respective.
Les sous-types de buvardage tels que nord, ouest & sud dépendent de la molécule cible recherchée. Lorsqu’une séquence d’ADN est la base ou le code d’une molécule de protéine, la molécule d’ADN particulière d’intérêt peut être épongée à l’aide de la technique de Southern Blot. Lors de l’expression des gènes, lorsque l’ADN est exprimé sous forme d’ARNm pour une production de protéines, ce processus peut être identifié par Northern blot. Enfin, l’ARNm codé produit la protéine concernée, cette identification protéique peut se faire par Western Blot.
Procédure générale de buvardage
- Homogénéiser l’échantillon.
- Séparation de la molécule d’intérêt par une membrane d’électrophorèse.
- Transfert des molécules sur une membrane nitro cellulosique / membrane de nylon.
- Hybridation ou identification de la molécule
Northern Blot
Le Northern Blot est une technique utilisée pour l’étude de l’expression des gènes. Elle se fait par détection d’ARN particulier (ou ARNm isolé). L’ARNm est généralement représenté par 5% de la séquence d’ARN globale. Cette méthode révèle l’identité, le nombre, l’activité et la taille du gène particulier. Cette technique de buvardage peut également être utilisée pour la croissance d’un tissu ou d’un organisme. À différents stades de différenciation et de morphogenèse, l’abondance d’un ARN change et cela peut être identifié à l’aide de cette technique. Il aide également à l’identification de l’état anormal, malade ou infecté au niveau moléculaire. La technique northern blot a été développée en 1977 par James Alwine, David Kemp et George Stank à l’Université de Stanford. La technique tire son nom de la similitude du processus avec le Southern blot. La principale différence entre ces deux techniques est que le northern blot ne concerne que l’ARN.
Principe
Comme toute technique de blot normale, le northern blot commence par l’électrophorèse pour séparer les échantillons d’ARN par taille. L’électrophorèse sépare les molécules d’ARN en fonction de la charge des acides nucléiques. La charge dans les acides nucléiques est proportionnelle à la taille de la séquence d’acides nucléiques. Ainsi, la membrane d’électrophorèse sépare la séquence d’acides nucléiques en fonction de la taille de la séquence d’ARN. Dans les cas où notre séquence cible est un ARNm, l’échantillon peut être isolé par des techniques chromatographiques d’oligocellulose, car les ARNm sont caractérisés par la queue poly(A). Les molécules de gel étant de nature fragile, les séquences séparées sont transférées sur les membranes en nylon. La sélection de la membrane de nylon contribue au facteur selon lequel les acides nucléiques sont de nature chargée négativement. Une fois les molécules d’ARN transférées, elles sont immobilisées par liaison covalente. La sonde est ensuite ajoutée, la sonde peut être complémentaire d’une séquence d’ADN ss. Le formamide est généralement utilisé comme tampon buvard car il réduit la température de recuit.
Procédure
- L’échantillon de tissu ou de culture collecté est d’abord homogénéisé. Les échantillons peuvent être représentatifs de différents types de culture à des fins de comparaison ou pour l’étude de différents stades de croissance à l’intérieur de la culture.
- La séquence d’ARN est séparée dans l’unité d’électrophorèse, un gel d’agarose est utilisé pour la séparation des acides nucléiques.
- Maintenant, la séquence d’ARN séparée est transférée sur la membrane de nylon. Cela se fait par deux mécanismes d’action capillaire et d’interaction ionique.
- L’opération de transfert se fait en maintenant le gel dans l’ordre suivant. Tout d’abord, le gel d’agarose est placé au fond de l’empilement, suivi de la membrane buvard. Au-dessus de ces serviettes en papier, un poids doux (plaque de verre) est placé. L’ensemble de la configuration est conservé dans un bécher contenant un tampon de transfert.
- L’ARN transféré sur la membrane de nylon est ensuite fixé par rayonnement UV.
- La membrane de nylon fixe est ensuite mélangée avec des sondes. Les sondes sont spécifiquement conçues pour le gène d’intérêt, de sorte qu’elles vont s’hybrider avec des séquences d’ARN sur le blot correspondent à la séquence d’intérêt.
- La membrane blot est lavée pour éliminer la sonde indésirable
- La sonde marquée est détectée par chimioluminescence ou autoradiographie. Le résultat sera des bandes sombres dans un film à rayons X.
Gel et sondes
Les échantillons d’ARN sont séparés à l’aide de gels d’agarose utilisant du formaldéhyde comme agent dénaturant mais dans de petites séquences d’ARN ou de micro-ARN, des séquences de polyacrylamide avec de l’urée comme agent dénaturant peuvent également être utilisées. Le bromure d’éthidium peut être utilisé comme agent de coloration. Deux types de marqueurs sont pour le marquage de taille. Une échelle d’ARN et une sous-unité ribosomique sont utilisées pour l’identification de la taille des séquences d’ARN.Les sondes
peuvent être complémentaires de tout ou partie de l’ARN d’intérêt. Il peut s’agir d’ARN, d’ADN ou d’oligonucléotides de 25 paires de base complémentaires à l’ARN cible. Dans le cas de sondes à ARN, les sondes produites par invitro sont utilisées car les sondes invivo peuvent se dénaturer en raison du lavage rigoureux. En cas d’ADNc, les sondes sont marquées avec des isotopes radioactifs, de la phosphatase alcaline ou de la peroxydase de raifort en cas de chimiluminescence.
