Comparaison entre la décalcification conventionnelle et une Méthode assistée par micro-ondes dans le Tissu osseux Atteint de mycétome

Résumé

Le mycétome est une maladie granulomateuse à vie des tissus et des os sous-cutanés. L’histopathologie est une méthode indicative étayée basée sur l’hypothèse d’un diagnostic définitif de mycétome. Il nécessite un traitement efficace des tissus, y compris la décalcification osseuse. Le processus de décalcification doit assurer l’élimination complète du calcium et également une bonne préservation de la capacité de coloration des tissus et des microorganismes. Objectifs. Comparer la méthode classique utilisée en décalcification avec la méthode micro-ondes utilisant différentes solutions de décalcification. Différentes caractéristiques ont été testées, notamment la vitesse de décalcification et la préservation morphologique et fongique du tissu osseux atteint de mycétome. Matériaux et méthodes. Trois solutions de décalcification ont été utilisées pour éliminer le calcium de 50 échantillons de tissu osseux atteints de mycétome, dont 10% d’EDTA tamponné neutre (pH 7,4), 5% d’acide nitrique et 5% d’acide chlorhydrique. Des méthodes conventionnelles et micro-ondes ont été utilisées. La teinture à l’hématoxyline-éosine (HE), la teinture de Gridley et la teinture à l’hexamine-argent de Grocott ont été utilisées pour évaluer la morphologie des os et des champignons. Résultat. Le temps de décalcification de la méthode conventionnelle par rapport à la méthode micro-ondes avec de l’EDTA à 10% (pH 7,4) a pris 120 heures et 29 heures, tandis que 5% d’acide chlorhydrique et 5% d’acide nitrique ont pris 8 heures et 3 heures, séparément. En outre, l’EDTA à 10% est le meilleur agent détartrant pour la coloration et les taches fongiques. 5% d’acide chlorhydrique et 5% d’acide nitrique peuvent être utilisés pour la coloration fongique. Conclusion. La présente étude a étudié les effets de différents agents décalcifiants ainsi que de deux procédures de décalcification sur la préservation de la structure osseuse et la coloration fongique, ce qui aidera à développer des protocoles appropriés pour les analyses du tissu osseux atteint d’une infection à mycétome.

1. Introduction

Le mycétome est une maladie épidémique granulomateuse et progressivement délétère de la peau et des tissus sous-cutanés qui peut évoluer vers des structures plus profondes comme les muscles et les os et entraîner une destruction étendue, principalement des pieds, nécessitant de larges excisions chirurgicales locales ou une amputation des membres. Le mycétome est défini par le triumvirat d’expansion, les sinus épuisants et l’existence de grains coloniaux dans les exsudats inflammatoires. L’infection est classée comme un eumycétome (infection fongique) ou un actinomycétome (infection bactérienne). C’est globalement une condition des régions tropicales et semi-tropicales, notamment du Soudan. Les grains de Madurella mycetomatis sont énormes, allant de 0,5 à 3 mm, et semblent arrondis, ovales ou trilobés. Ils sont constitués d’hyphes entrecroisés enracinés dans du ciment brun interstitiel, constitué d’un pigment brun noir ressemblant à de la mélanine. L’histopathologie est une méthode indicative rapide ainsi qu’un processus avantageux sur l’hypothèse d’un diagnostic définitif de la maladie du mycétome et comprend un rapport qui décrit la présentation morphologique des agents responsables. L’agent causal pourrait encore être isolé du tissu osseux impliqué. La décalcification est une étape fondamentale couramment atteinte pour l’examen histopathologique des os. Les minéraux dans les os sont constitués de calcium et de phosphore, et les sels insolubles représentent plus de soixante pour cent du tissu osseux. Ces minéraux fournissent la dureté osseuse et sont à l’origine de difficultés lors de la coupe des tissus à l’aide de microtomes rotatifs. Ces tissus doivent être traités pour extraire le phosphate de calcium par une procédure appelée décalcification, en rendant le tissu suffisamment délicat pour être coupé par le microtome. La décalcification est réalisée par des acides qui forment des sels de calcium solubles ou des agents chélateurs qui se lient aux ions calcium. Les méthodes de décalcification conventionnelles actuelles sont caractérisées par des processus laborieux et l’échec persistant de la réaction de coloration des tissus. Dans la méthode conventionnelle de décalcification, les tissus osseux sont placés dans un liquide décalcifiant à température ambiante avec des changements de solution à intervalles réguliers jusqu’à ce que le point final soit atteint. La décalcification par micro-ondes est une technique innovante par rapport à la méthode conventionnelle. Dans ce procédé, des tissus solides sont placés dans la solution décalcifiante dans un four à micro-ondes pendant des durées périodiques avec des déplacements habituels des fluides décalcifiants jusqu’à ce que le point final soit atteint. Le rayonnement micro-ondes a été effectué pour accélérer la procédure de décalcification environ de quelques jours à quelques heures. Le but de la présente étude était de comparer la méthode conventionnelle utilisée en décalcification avec la méthode micro-ondes modifiée utilisant différentes solutions de décalcification. Différentes caractéristiques ont été testées, y compris la vitesse de décalcification et la conservation morphologique et fongique dans le tissu osseux affecté par l’infection à Madurella mycetomatis.

2. Matériaux et méthodes

Il s’agit d’une étude descriptive expérimentale visant à comparer la procédure de décalcification conventionnelle avec une décalcification améliorée par micro-ondes en ce qui concerne la morphologie des tissus affectés par une infection à mycétome en utilisant des taches d’hématoxyline et d’éosine, de Gridley et de Grocott hexamine-argent pour une identification complète des organismes causaux de Madurella mycetomatis. Cette étude a été menée au Centre de Recherche sur le mycétome de l’Hôpital universitaire de Soba et à la Faculté des Sciences de Laboratoire Médical de l’Université d’Al Neelain. Le consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les patients. Cinquante membres amputés atteints de mycétome ont été collectés. Les biopsies osseuses ont été découpées à l’aide d’une scie appropriée en morceaux de 5 mm d’épaisseur, puis fixées dans une solution saline formelle à 10% pendant 48 heures. Ils ont été lavés sous l’eau courante du robinet pendant 30 minutes pour retirer le fixateur.

2.1. Procédure conventionnelle de décalcification

Trois morceaux de biopsies osseuses de 5 mm d’épaisseur ont été immergés dans trois béchers Squat en Pyrex de 250 ml contenant chacun 100 ml d’acide chlorhydrique aqueux (HCl) à 5%, d’acide nitrique aqueux (HNO3) à 5% et d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 10% placés à température ambiante (28 °C en moyenne), voir Tableau 1. Le point final de la décalcification a été vérifié à l’aide de la méthode de l’oxalate de calcium pour les deux décalcifiants acides (HNO3 à 5% et HCl à 5%) après un intervalle de deux heures comme suit: 5 ml du liquide détalcifiant utilisé ont été prélevés et placés dans un tube à essai, puis du papier de tournesol a été ajouté et de l’hydroxyde d’ammoniac a été ajouté goutte à goutte jusqu’à ce que le papier de tournesol change, indiquant que le liquide détalcifiant à pH alcalin était clair. 5 ml de solution saturée d’oxalate d’ammonium ont été ajoutés lorsque la solution décalcifiante est devenue trouble, indiquant la présence de calcium dans le tissu osseux, de sorte que la solution décalcifiante a été remplacée par une nouvelle solution, et le processus a été répété toutes les 30 minutes jusqu’à la fin du processus de décalcification. Pour l’EDTA, des tests physiques de décalcification ont été utilisés dans lesquels le processus de décalcification était considéré comme terminé lorsque l’os était facilement traversé par une aiguille. Les temps décalcifiés totaux moyens étaient de 7 heures et 30 minutes, 8 heures et 120 heures pour 5% d’acide nitrique, 5% d’HCl et 10% d’EDTA, respectivement.

2.2. Procédure du four à micro-ondes

Un four à micro-ondes domestique (Midea Microwave 20L, 700W, Digital, EM720CFF) avec une plaque tournante immobile a été utilisé. Un bécher en verre contenant 100 ml d’eau distillée a été préchauffé pendant 5 secondes pour réchauffer le magnétron. Celui-ci a été remplacé par 100 ml d’eau distillée fraîche et irradié pour maintenir la température autour de 41-43 °C. Cela a pris 15 secondes. Le bécher en verre a été réparti en différents points du four tout en l’irradiant pour résoudre le meilleur emplacement de l’échantillon lors de la décalcification à micro-ondes, car le four à micro-ondes utilisé avait un temps constant mais pas une température constante. Trois morceaux de coupes de biopsies osseuses de 5 mm d’épaisseur ont été immergés dans des béchers Squat en Pyrex de 250 ml contenant 100 ml d’acide chlorhydrique aqueux à 5% (HCl), d’acide nitrique aqueux à 5% (HNO3) et d’EDTA à 10%. Ensuite, ils ont été transférés au four à micro-ondes et les échantillons ont été irradiés pendant dix cycles de dix secondes chacun (à intervalles de 15 minutes) pendant une durée totale de 2 à 4 heures pour les décalcifiants acides (5% HNO3 et 5% HCl). La température de la solution décalcifiante a été maintenue autour de 41-43 ° C. La solution décalcifiante et le point final de la décalcification ont été vérifiés et la solution décalcifiante a été changée à plusieurs reprises jusqu’à la fin de la décalcification. Le point final de décalcification a été vérifié à l’aide d’oxalate de calcium et de tests physiques comme mentionné ci-dessus. Les temps décalcifiés totaux moyens étaient de 3 heures et 45 minutes, de 5 heures et 30 minutes et de 29 heures et 4 minutes pour 5% d’acide nitrique, 5% d’HCl et 10% d’EDTA, respectivement. Après décalcification complète, les tissus ont été lavés à l’eau distillée et transférés dans une solution d’ammoniac à 0,3% pendant 5 minutes pour neutraliser l’acide utilisé.

2.3. Traitement et coloration des tissus

Les échantillons ont été soumis à un traitement automatique des tissus selon les protocoles suivants: les biopsies osseuses ont été placées dans une solution saline formelle à 10% pendant une heure. Ensuite, 50% d’alcool une heure, 70% d’alcool une heure, 90% d’alcool une heure, suivi de 100% d’alcool trois changements toutes les deux heures chacun, deux changements de xylène, chacun pendant une heure et demie, enfin deux changements de cire de paraffine pendant deux heures chacun. Les tissus ont été noyés dans des blocs de paraffine et ont été sectionnés sur une épaisseur de 5-6 µm à l’aide d’un microtome rotatif. Les sections ont été colorées avec de l’hématoxyline de Mayer, comme décrit par Mayer en 1903, et la contre-coloration de chacune était de 1% d’éosine (HE). La tache de Gridley a été utilisée pour la démonstration de champignons telle que décrite par Gridley en 1953); après deparaffinisation et réhydratation, des coupes tissulaires ont été placées dans de l’acide chromique à 2% pendant 30 minutes. Ils ont ensuite été bien lavés à l’eau du robinet, rincés à l’eau distillée, puis placés dans le réactif de Schiff pendant 20 minutes. Ils ont ensuite été lavés à l’eau courante du robinet pendant 10 minutes et rincés à 70% d’éthanol puis à 95% d’éthanol. Ils ont été contre-colorés au Métanil jaune pendant une minute et bien rincés à l’eau distillée. Ensuite, ils ont été déshydratés dans du xylène et montés dans du distyrène, un plastifiant et du xylène (DPX). Ensuite, les coupes ont été examinées au microscope. En outre, la méthode Grocott hexamine-argent pour les champignons telle que décrite par Grocott en 1955 a été utilisée dans laquelle des sections ont été oxydées avec de l’acide chromique aqueux à 4% pendant une heure, lavées à l’eau pendant quelques secondes, traitées avec du métabisulfite de sodium à 1% pendant une minute, lavées à l’eau courante du robinet pendant 3 minutes, rincées abondamment à l’eau distillée, placées dans une solution d’argent de travail préchauffée au bain-marie à 60 ° C pendant 20 minutes, bien rincées à l’eau distillée, lavées à l’eau courante du robinet pendant 5 minutes, contre-colorées en vert clair de travail pendant 15 minutes secondes, déshydratées et nettoyées au xylène et montées en DPX, et finalement examiné au microscope.

2.4. Évaluation des résultats

Les sections ont été évaluées par un histopathologiste expert. La qualité de la procédure de décalcification et le résultat de la coloration ont également été évalués et évalués selon la règle empirique, et la qualité de la décalcification a été évaluée selon les critères suivants: le moment de la décalcification, la préservation morphologique de la morphologie des tissus et les champignons Madurella mycetomatis par HE; La coloration à la méthénamine-argent de Gridley et Grocott a été notée de 1 à 4 (1: médiocre, 2: passable, 3: bonne et 4: excellente).

2.5. Analyse statistique

L’analyse des données a été effectuée à l’aide du programme SPSS. L’ANOVA unidirectionnelle a été utilisée pour prouver l’effet des trois solutions décalcifiantes sur l’analyse quantitative de la qualité des sections et de la préservation des champignons. Le test de Kruskal–Wallis a été effectué pour déterminer s’il existait une différence significative entre les solutions testées pour chacun des paramètres évalués avec les deux expériences. Les différences avec ont été interprétées comme étant statistiquement significatives.

3. Résultats

Cinquante cas de Madurella mycetomatis à grain noir ont été inclus dans l’étude. Les pieds étaient la région anatomique la plus touchée dans 48 cas (96%) et dans deux cas (4,0%) de la main. En ce qui concerne le temps de décalcification dans différentes expériences, parmi les trois solutions testées, la décalcification avec de l’EDTA à 10% (pH 7,4) a pris le temps le plus long pour la méthode classique (jusqu’à 120 heures contre 29 heures avec le micro-ondes), et l’utilisation d’une solution acide-décalcifiante a pris le temps le plus court allant de 8 heures à 3 heures pour différentes méthodes de décalcification. La qualité de la morphologie tissulaire des différents types de solution décalcifiante utilisant la méthode micro-onde de décalcification par rapport à la méthode classique avec coloration à l’hématoxyline et à l’éosine de Mayer en ce qui concerne l’aspect nucléaire et cytoplasmique a obtenu des résultats variables. De plus, 10% d’os décalcifiés à l’EDTA semblaient avoir un résultat significativement supérieur (valeur de P en utilisant le test du chi carré: 0,023) par rapport à 5% d’HNO3 et 5% d’HCl. L’excellent rapport de coloration était de 43 (86%) par rapport à 32 (64%), 42 (84%) contre 18 (36 %), et 33 (66 %) contre 1 (2 %), respectivement. La méthode de coloration à la méthénamine-argent de Grocott a été utilisée pour la démonstration de l’agent causal de Madurella mycetomatis concernant la morphologie et la luminosité des champignons, et les coupes de tissus décalcifiées par 10% d’EDTA, 5% d’HNO3 et 5% d’HCl en utilisant des méthodes conventionnelles et micro-ondes ont montré une morphologie fongique significativement meilleure (valeur P en utilisant le test du chi carré: 0,001) comme suit: 33 (66%) par rapport à 32 (64%), 33 (66%) contre 39 (78 %), et 22 (44 %) contre 31 (62 %), respectivement. L’autre tache fongique utilisée pour Madurella mycetomatis était la tache de Gridley concernant la morphologie fongique et la qualité de coloration des os décalcifiés avec 10% d’EDTA, 5% d’HNO3 et 5% d’HCl en utilisant les méthodes conventionnelles et micro-ondes qui ont montré des résultats significativement meilleurs (valeur P en utilisant le test du chi carré: 0,003) comme suit: 43 (86%) par rapport à 41 (82%), 32 (64%) contre 34 (68 %), et 23 (46 %) contre 35 (70 %), respectivement. Ces résultats sont résumés dans le tableau 2. La figure 1 montre les résultats de coloration en utilisant différents agents et conditions décalcifiants.

Figure 1

Démonstration des résultats de coloration à l’aide de différents agents et conditions décalcifiants.

4. Discussion

L’identification histopathologique de l’agent causal de Madurella mycetomatis est bien établie car il s’agit de la procédure étalon-or; cependant, les tissus durs et les os nécessitent une décalcification spéciale pour préserver la structure tissulaire et la morphologie de l’agent causal. Les agents responsables peuvent être identifiés à l’aide de taches spéciales d’hématoxyline et d’éosine (HE) et de champignons, de sorte que l’os nécessite un protocole de décalcification standard qui préserve les tissus, la morphologie de l’agent causal et la capacité de coloration. La décalcification osseuse est une technique fastidieuse. Cela nécessite des semaines, et la conservation de la configuration tissulaire dépend de l’excellence et de la rapidité de la procédure de décalcification. Un nouveau procédé utilisant un four à micro-ondes a été réalisé pour accélérer le processus de décalcification. La sélection de l’agent et de la manière décalcifiants est essentiellement déterminée par le sérieux de la méthode, et les utilisations possibles de l’énergie micro-ondes dans les techniques histologiques ont été documentées pour la première fois par Mayers en 1970. Ce système de méthode d’émission non ionisante a été pensé pour accélérer le processus de décalcification. La cinétique moléculaire provoque alors la production d’un changement d’énergie, qui dure jusqu’à l’arrêt du rayonnement. Dans cette étude, les temps de décalcification rapportés pour la décalcification améliorée par micro-ondes et la procédure de décalcification conventionnelle étaient respectivement de 29 et 120 heures avec de l’EDTA à 10% (pH 7,4), de trois heures et sept heures avec de l’acide nitrique à 5% et de cinq et huit heures avec du HCl à 5%. Il est clair que la méthode de décalcification par micro-ondes pour le tissu osseux atteint d’une infection à mycétome était significativement plus rapide que la méthode conventionnelle. De plus, l’acide nitrique à 5% avait une capacité de décalcification plus rapide suivie de l’acide chlorhydrique à 5%, puis de l’EDTA (pH 7,4) pour les deux méthodes. Pitol et coll. utilisé une cuisinière à micro-ondes domestique pour éliminer le calcium de l’os de rat par une solution d’EDTA à 8,5% et a montré une diminution de la période d’essai de 45 jours dans le processus conventionnel à 48 h dans le processus assisté par micro-ondes. Dans ce travail, la solution d’EDTA à 10% a pris 120 heures dans la méthode conventionnelle et 29 heures en utilisant des micro-ondes pour obtenir une décalcification complète du tissu osseux affecté par une infection à mycétome. La concentration d’EDTA dans notre expérience était supérieure à celle de Pitol et al.l’étude. En plus des différences de taille, d’épaisseur et de types d’os, celles-ci peuvent expliquer l’augmentation du temps de décalcification chez Pitol et al.étude qui ont été réduites dans notre cadre. De plus, la décalcification de l’os atteint d’une infection à mycétome avec la méthode conventionnelle utilisant de l’acide nitrique à 5% a pris sept heures, alors que la méthode au four à micro-ondes a pris trois heures. Balaton et Loget ont obtenu des résultats comparables. De plus, dans cette recherche, les temps de décalcification ont été réduits par rapport à d’autres études. Les temps de décalcification rapportés pour les méthodes classiques et micro-ondes allaient d’un jour et de quatre heures à 5 jours et sont considérés comme faibles par rapport à d’autres études sur l’os de rongeur, qui ont rapporté des temps compris entre 2 et 7 jours avec des solutions de décalcification acide et de l’EDTA à 10% (pH 7,4), respectivement. Shibata et son groupe ont rapporté des temps de décalcification presque similaires qui variaient de 1 jour à 7 jours avec 10% d’HCl, 10% d’acide nitrique et 10% d’EDTA. Cependant, ils ont utilisé des décalcificateurs acides avec des concentrations plus élevées. Uma et coll. on a évalué les effets de quatre liquides décalcifiants différents en utilisant une décalcification par micro-ondes dans l’os de rat et rapporté 1 à 1,5 jour pour 5% d’acide nitrique et 7% d’HCl / 2% d’EDTA. Cependant, 10% d’EDTA a pris de 14 à 26 jours selon le type d’os. Dans ces études, le type d’os, la nature et la taille variaient et différaient de ceux analysés ici. La procédure de décalcification était une raison clé de la supériorité de la section tissulaire et de la précision de la coloration. Philipp et coll. (2019) ont décrit que la méthode de décalcification provoque des changements morphologiques importants qui modifient la structure protéique et affectent la capacité de coloration du tissu. Dans notre étude, l’os a été traité avec de l’acide nitrique à 5% avec la méthode manuelle de routine, et il y avait un gonflement des tissus mous et une perte de coloration nucléaire et fongique par rapport à la décalcification assistée par micro-ondes. Les agents décalcifiants acides perturbent généralement la constance des os et des tissus mous. Ces effets spéciaux dans l’acide nitrique à 5% sont dus à la période prise et à l’acidité de la solution. Ainsi, une décalcification plus rapide provoquera des blessures plus importantes et des effets plus importants dans H& E et une tache spéciale fongique. Plusieurs champignons peuvent être démontrés avec une section histologique en utilisant des taches histochimiques telles que la tache de méthénamine-argent (GMS) de Grocott et / ou la tache de Gridley (GS). Certains champignons peuvent être démontrés exactement dans les tissus sur la base de structures morphologiques; cependant, l’efficacité de la reconnaissance avait tendance à diminuer après une fixation prolongée et une décalcification à l’aide de méthodes conventionnelles. Dans cette étude, la décalcification assistée par micro-ondes a donné une coloration supérieure par rapport à la méthode conventionnelle de morphologie utilisant H& E et une teinture spéciale fongique, où l’EDTA à 10% était la solution qui préservait le mieux les structures tissulaires et la capacité de coloration fongique malgré un long temps de décalcification.

5. Conclusion et recommandations

La décalcification renforcée par l’utilisation d’un four à micro-ondes est une nouvelle technique de décalcification. Cette technique a été étudiée dans le tissu osseux affecté par une infection à Madurella mycetomatis en utilisant 10% d’EDTA, 5% d’acide nitrique et 5% d’acide chlorhydrique comme fluides décalcifiants. Ceci a été comparé à la décalcification conventionnelle à température ambiante pour déterminer la vitesse de décalcification et la morphologie des tissus en utilisant la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine de Mayer pour la structure osseuse et les taches de Grocott et de Gridley pour la morphologie fongique. De meilleurs résultats ont été obtenus par rapport à la méthode conventionnelle à la fois en morphologie cellulaire et en spores et hyphes de champignons avec une luminosité réduite des champignons à température ambiante. Cette découverte peut aider à développer des protocoles appropriés pour les analyses du tissu osseux atteint d’une infection à mycétome.

6. Limites de la présente étude

Une taille d’échantillon plus importante aurait donné des résultats plus concluants. De plus, les temps de décalcification sont susceptibles d’être différents si différents poids osseux et échantillons osseux autres que les mains sont utilisés, car le temps de décalcification dépend de la taille et de la densité structurelle du tissu dur. Enfin, puisque nous avons utilisé un four à micro-ondes domestique, nos enregistrements de température n’ont peut-être été qu’approximatifs.

Disponibilité des données

Les ensembles de données générés au cours de la présente étude sont disponibles auprès de l’auteur correspondant sur demande raisonnable.

Approbation éthique

Cette étude a été approuvée par le Conseil d’examen Institutionnel de la Faculté des Sciences de Laboratoire Médical de l’Université d’Al Neelain.

Conflits d’intérêts

L’auteur déclare qu’il n’y a pas de conflits d’intérêts.

Remerciements

L’auteur souhaite exprimer sa sincère gratitude au personnel du Centre de recherche sur le mycétome de l’Université de Khartoum, Khartoum, Soudan, et une appréciation particulière aux professeurs Ahmed Hassan Fahal et Ahmed Mohammed El Hassan, professeur émérite de pathologie, pour leur aide.

Matériaux supplémentaires

Les matériaux et réactifs utilisés pour étayer les résultats de cette étude sont inclus dans les informations supplémentaires. (Matériel supplémentaire)