10.4.2 Le tréhalose pour la cryoconservation de cellules de mammifères
La cryoconservation a été couramment utilisée pour la conservation de cellules sur de longues périodes à des températures extrêmement basses. Cependant, les changements physiques qui se produisent pendant la congélation et la décongélation peuvent nuire à la survie et aux fonctions cellulaires. Par conséquent, des cryoprotecteurs doivent être ajoutés aux cellules pendant la cryoconservation. L’utilisation du tréhalose comme cryoprotecteur pour les cellules est née de l’idée que des composés polyhydroxy sont nécessaires des deux côtés de la membrane cellulaire pour que les cellules soient conservées plus longtemps. Le tréhalose a été exploré par plusieurs groupes comme protecteur pour la cryoconservation de diverses cellules humaines.
Beattie et coll. introduction du tréhalose avec du DMSO dans les cellules de Langerhans pancréatiques en utilisant une transition de phase liquide thermotrope. La cryoconservation avec le tréhalose a entraîné une récupération de 92% des îlots adultes, comparativement à seulement 58% en utilisant le DMSO seul. Quatorze fois plus d’insuline a été trouvée dans les greffons des îlots cryoconservés avec du tréhalose que ceux sans tréhalose. Le taux de récupération des amas de cellules ressemblant à des îlots fœtaux humains cryoconservés avec le tréhalose était de 94 %, comparativement à seulement 42 % pour ceux sans tréhalose. Lors de la transplantation chez des souris nues, une augmentation de 15 fois de la teneur en insuline des greffons provenant de la cryoconservation ICC avec du tréhalose a été observée. Ces résultats indiquent que l’ajout de tréhalose comme cryoconservant entraîne des taux de survie très élevés du tissu endocrinien pancréatique humain.
Toner et ses collègues ont introduit de faibles concentrations de tréhalose dans les cellules de mammifères en utilisant une version génétiquement modifiée de la protéine formant des pores alpha-hémolysine, et ont découvert que le tréhalose intracellulaire peut grandement améliorer la survie de ces cellules pendant la cryoconservation. Les taux de survie à long terme après dégel des fibroblastes de souris cryoconservés et des kératinocytes humains étaient respectivement de 80 % et 70 %, à une concentration intracellulaire de tréhalose de 0,2 M. Le tréhalose intracellulaire a également un effet bénéfique sur l’intégrité membranaire des cellules de mammifères séchées, avec une récupération de plus de 90% de la membrane plasmique intacte observée lors du séchage et du stockage des cellules dans des conditions douces pendant plusieurs semaines.
L’effet du tréhalose sur la cryoconservation des hépatocytes humains a été étudié par Katenz et al. . Les cellules hépatiques congelées dans un milieu de culture contenant 10% de DMSO et 0,2 M de tréhalose ont montré une amélioration significative de la viabilité des cellules post-décongélation et de l’efficacité du placage par rapport au DMSO seul. La présence de tréhalose pendant la cryoconservation a également entraîné une augmentation du taux de protéines totales dans les cellules attachées, des niveaux de sécrétion d’albumine plus élevés et des niveaux d’aspartate amino transférase plus faibles après décongélation.
Les cellules souches sont des outils importants pour l’étude de l’hématopoïèse, le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ainsi que des systèmes modèles pour certaines maladies. Malgré les développements de la cryoconservation, la mort cellulaire post-dégel reste un problème majeur. Martinetti et coll. tréhalose utilisé pour cryoconserver les cellules souches et progénitrices hématopoïétiques pures du sang périphérique afin de prévenir la perte de cellules qui se produit au cours normal de la cryoconservation. L’expression du marqueur de tige de surface CD34 a été évaluée et le tréhalose de 1 M a été trouvé pour fournir une cryoprotection améliorée aux cellules CD34+ avec un nombre de cellules et une viabilité cellulaires plus élevés par rapport à la méthode de congélation standard utilisant le DMSO. De plus, la cryoconservation avec le tréhalose pendant des périodes plus courtes et plus longues a conservé la capacité des cellules CD34+ à se différencier en cellules mégacaryopoïétiques après décongélation. Ces résultats suggèrent la capacité du tréhalose à conserver la viabilité et les fonctions des cellules souches lorsqu’il est utilisé comme cryoprotecteur.
Le stockage à long terme des globules rouges et des plaquettes tout en maintenant un degré élevé de viabilité a des implications importantes dans la transfusion sanguine et la médecine clinique. Satpathy et coll. l’invention concerne une méthode de chargement des CBR avec du tréhalose à partir d’un milieu extracellulaire utilisant un déséquilibre osmotique et une transition de phase phospholipidique qui a abouti à des concentrations intracellulaires de tréhalose de 40 mM. On a constaté que le tréhalose exerçait une protection osmotique des CBR pendant de plus longues périodes. La lyophilisation des globules rouges chargés de tréhalose suivie d’une réhydratation a entraîné une survie de 55% avec rétention de leur morphologie. Les cellules survivantes synthétisaient de l’ATP et du 2,3-diphosphoglycérate (DPG) et présentaient de faibles taux de méthémoglobine. L’activité de la SOD et de la catalase et la structure secondaire de l’hémoglobine dans les globules rouges lyophilisés étaient toutes très similaires à celles des globules rouges frais. Cette étude a démontré que la charge en tréhalose était nécessaire à la stabilisation de l’hémoglobine et constituait une étape importante vers la cryoconservation des globules rouges.
La durée normale de conservation des plaquettes sanguines humaines dans les banques de sang est de 5 jours après quoi elles sont jetées, ce qui entraîne une pénurie chronique de plaquettes nécessaires à la transfusion. Dans le cadre d’un effort de cryoconservation des plaquettes pendant de plus longues périodes, Wolkers et al. décrit une méthode d’introduction du tréhalose dans le cytoplasme des plaquettes sanguines humaines. On a constaté que le tréhalose était facilement absorbé par les plaquettes humaines à 37 °C avec une efficacité de chargement de plus de 50%. La lyophilisation et la réhydratation des plaquettes chargées de tréhalose ont permis une excellente récupération des plaquettes intactes avec un taux de survie de 85%. Ces plaquettes ont répondu de manière presque identique aux plaquettes fraîches vers des agonistes tels que la thrombine, l’ADP, le collagène et la ristocétine. Les microdomaines membranaires et les composants protéiques des plaquettes chargées de tréhalose ont été maintenus intacts après lyophilisation et réhydratation.
L’effet protecteur du tréhalose a également été démontré dans les cellules épithéliales cornéennes dessiccées. La préincubation de cellules épithéliales cornéennes en culture avec du tréhalose suivie d’un séchage a entraîné une réduction significative du pourcentage de cellules mortes par rapport au milieu témoin. L’effet protecteur a également été confirmé ex vivo dans des yeux de porc énucléés, où le tissu incubé avec du tréhalose était visiblement plus lisse. Ces résultats indiquent l’utilité du tréhalose en ophtalmologie et son application potentielle comme collyre pour le syndrome de l’œil sec.
L’utilisation du tréhalose pour la cryoconservation des organites a été démontrée par Yamaguchi et al., qui a utilisé le tréhalose comme cryoprotecteur pour les mitochondries congelées. Les mitochondries congelées en présence de tréhalose présentaient une intégrité de la membrane externe mitochondriale (MOM) et une réactivité aux protéines de la famille Bcl-2 similaires à celles des mitochondries fraîches. L’ultrastructure, la synthèse de l’ATP, le potentiel transmembranaire, le gonflement induit par le calcium et l’importation et le traitement de protéines précurseurs ont également été préservés en présence de tréhalose. Ceci est différent du tampon standard saccharose-mannitol utilisé pour congeler les mitochondries qui deviennent souvent des fuites. Ainsi, le tréhalose a pu conserver la plupart des caractéristiques biologiques des mitochondries et les mitochondries congelées au tréhalose peuvent être utilisées pour la recherche sur l’apoptose et d’autres fonctions mitochondriales qui reposent sur l’intégrité de la MOM.
Le tréhalose a été utilisé pour la conservation des organes sur de longues périodes. Une « solution ET-Kyoto » a été développée par le groupe de l’Ama pour la préservation du poumon canin pendant > 30 heures sans affecter les performances des cellules endothéliales et du système vasculaire. La stabilisation et la conservation prolongées des vaccins et des anticorps ont également été obtenues en utilisant le tréhalose.
