G418

G418 (Généticine, Invitrogène): Dissoudre dans l’eau à 200 mg / ml, stériliser par filtre et conserver en aliquotes à 4 ° C.

clonNAT (nourseothricine, Werner BioAgents, Iéna, Allemagne): Dissoudre dans l’eau à 100 mg / ml, stériliser par filtre et conserver en aliquotes à 4 ° C.

Canavanine (sel de sulfate de l-canavanine, Sigma, C-9758): Dissoudre dans de l’eau à 100 mg / ml, filtrer stériliser et conserver en aliquotes à 4 ° C.

Thialysine (chlorhydrate de S-(2-aminoéthyl)-l-cystéine, Sigma, A-2636): Dissolve in water at 100 mg/ml, filter sterilize, and store in aliquots at 4 °C.

Amino acids supplement powder mixture for synthetic media (complete): Contains 3 g adenine (Sigma), 2 g uracil (ICN), 2 g inositol, 0.2 g para-aminobenzoic acid (Acros Organics), 2 g alanine, 2 g arginine, 2 g asparagine, 2 g aspartic acid, 2 g cysteine, 2 g glutamic acid, 2 g glutamine, 2 g glycine, 2 g histidine, 2 g isoleucine, 10 g leucine, 2 g lysine, 2 g methionine, 2 g phenylalanine, 2 g proline, 2 g serine, 2 g threonine, 2 g tryptophan, 2 g tyrosine, and 2 g valine (Fisher). Le mélange de poudre Drop-out (DO) est une combinaison des ingrédients ci-dessus moins le supplément approprié. Deux grammes du mélange de poudre de DO sont utilisés par litre de milieu.

Supplément d’acides aminés pour milieu de sporulation: Contient 2 g d’histidine, 10 g de leucine, 2 g de lysine, 2 g d’uracile; 0,1 g du mélange de poudre de suppléments d’acides aminés est utilisé par litre de milieu de sporulation.

Glucose (Dextrose, Fisher): Préparer une solution à 40%, autoclave et conserver à température ambiante.

YEPD: Ajouter 120 mg d’adénine (Sigma), 10 g d’extrait de levure, 20 g de peptone, 20 g de gélose bacto (BD Difco) dans 950 ml d’eau dans un flacon de 2 l. Après l’autoclavage, ajouter 50 ml de solution de glucose à 40%, bien mélanger, refroidir à ~ 65 ° C et verser les assiettes.

YEPD + G418: Refroidir le milieu YEPD à ~ 65 °C, ajouter 1 ml de solution mère G418 (concentration finale 200 mg/l), bien mélanger et verser les assiettes.

YEPD + clonNAT: Refroidir le milieu YEPD à ~ 65 °C, ajouter 1 ml de solution mère de clonNAT (concentration finale 100 mg/l), bien mélanger et verser les assiettes.

YEPD+G418 /clonNAT: Refroidir le milieu YEPD à ~ 65 ° C, ajouter 1 ml de solutions mères G418 (concentration finale 200 mg / l) et 1 ml de solutions mères clonNAT (concentration finale 100 mg / l), bien mélanger et verser les plaques.

Sporulation enrichie: Ajouter 10 g d’acétate de potassium (Fisher), 1 g d’extrait de levure, 0,5 g de glucose, 0,1 g de mélange de poudre de supplément d’acides aminés pour la sporulation, 20 g de gélose bacto dans 1 l d’eau dans un flacon de 2 l. Après autoclavage, refroidir le milieu à ~ 65 °C, ajouter 250 µl de solution mère G418 (concentration finale 50 mg/l), bien mélanger et verser les plaques.

(SD / MSG) − His / Arg / Lys + canavanine / thialysine / G418: Ajouter 1,7 g de base azotée de levure sans acides aminés ou sulfate d’ammonium (BD Difco), 1 g de MSG (hydrate de sel de sodium de l’acide l-glutamique, Sigma), 2 g de mélange de poudre de supplément d’acides aminés (DO−His / Arg / Lys), 100 ml d’eau dans un flacon de 250 ml. Ajouter 20 g de gélose bacto dans 850 ml d’eau dans un flacon de 2 l. Autoclave séparément. Mélanger les solutions autoclavées, ajouter 50 ml de glucose à 40%, refroidir le milieu à ~ 65 ° C, ajouter 0,5 ml de canavanine (50 mg / l), 0,5 ml de thialysine (50 mg / l) et 1 ml de solutions mères G418 (200 mg / l), bien mélanger et verser les assiettes. Le sulfate d’ammonium empêche la fonction de G418 et de clonNAT. Par conséquent, le milieu synthétique contenant ces antibiotiques est fabriqué avec de l’acide glutamique monosodique comme source d’azote (Cheng et al., 2000).

(SD / MSG) − His / Arg / Lys + canavanine / thialysine / clonNAT: Ajouter 1,7 g de base azotée de levure sans acides aminés ou sulfate d’ammonium, 1 g de MSG, 2 g de mélange de poudre de supplément d’acides aminés (DO−His / Arg / Lys), 100 ml d’eau dans un flacon de 250 ml. Ajouter 20 g de gélose bacto dans 850 ml d’eau dans un flacon de 2 l. Autoclave séparément. Combiner les solutions autoclavées, ajouter 50 ml de glucose à 40%, refroidir le milieu à ~ 65 ° C, ajouter 0.5 ml de canavanine (50 mg / l), 0,5 ml de thialysine (50 mg / l) et 1 ml de solutions mères de clonNAT (100 mg / l), bien mélanger et verser les plaques.

(SD / MSG) − His / Arg / Lys + canavanine / thialysine / G418 / clonNAT: Ajouter 1,7 g de base azotée de levure sans acides aminés ou sulfate d’ammonium, 1 g de MSG, 2 g de mélange de poudre de supplément d’acides aminés (DO−His / Arg / Lys), 100 ml d’eau dans un flacon de 250 ml. Ajouter 20 g de gélose bacto dans 850 ml d’eau dans un flacon de 2 l. Autoclave séparément. Combiner les solutions autoclavées, ajouter 50 ml de glucose à 40%, refroidir le milieu à ~ 65 ° C, ajouter 0,5 ml de Canavanine (50 mg / l), 0.5 ml de solution mère thialysine (50 mg/l), 1 ml de solution mère G418 (200 mg /l) et 1 ml de solution mère clonNAT (100 mg /l), bien mélanger et verser les plaques.

(SD / MSG) Complet: Ajouter 1,7 g de levure à base d’azote sans acides aminés ou sulfate d’ammonium, 1 g de MSG, 2 g de mélange de poudre de supplément d’acides aminés (complet), 100 ml d’eau dans un flacon de 250 ml. Ajouter 20 g de gélose bacto dans 850 ml d’eau dans un flacon de 2 l. Autoclave séparément. Mélanger les solutions autoclavées, ajouter 50 ml de glucose à 40%, bien mélanger, refroidir le milieu à ~ 65 ° C et verser les assiettes.

SD-His/Arg/Lys + canavanine/thialysine : Ajouter 6.7 g de base azotée de levure sans acides aminés (BD Difco), 2 g de mélange de poudre de supplément d’acides aminés (DO−His / Arg / Lys), 100 ml d’eau dans un flacon de 250 ml. Ajouter 20 g de gélose bacto dans 850 ml d’eau dans un flacon de 2 l. Autoclave séparément. Mélanger les solutions autoclavées, ajouter 50 ml de glucose à 40%, refroidir le milieu à ~ 65 ° C, ajouter 0,5 ml de canavanine (50 mg /l) et 0,5 ml de thialysine (50 mg /l), bien mélanger et verser les plaques. Ce milieu ne contient aucun antibiotique tel que G418 ou clonNAT et donc du sulfate d’ammonium est utilisé comme source d’azote.

SD-Leu / Arg / Lys + canavanine / thialysine: Ajouter 6,7 g de base azotée de levure sans acides aminés, 2 g de mélange de poudre de supplément d’acides aminés (DO-Leu / Arg / Lys), 100 ml d’eau dans un flacon de 250 ml. Ajouter 20 g de gélose bacto dans 850 ml d’eau dans un flacon de 2 l. Autoclave séparément. Mélanger les solutions autoclavées, ajouter 50 ml de glucose à 40%, refroidir le milieu à ~ 65 ° C, ajouter 0,5 ml de canavanine (50 mg /l) et 0,5 ml de thialysine (50 mg /l), bien mélanger et verser les plaques.