RÉSUMÉ
Virus de la grippe La neuraminidase (NA) joue un rôle essentiel dans la libération et la propagation des virions descendants, après le cycle de réplication virale intracellulaire. Pour tester si la NA pouvait également faciliter l’entrée du virus dans la cellule, nous avons infecté des cultures d’épithélium des voies respiratoires humaines avec des virus de la grippe humaine et aviaire en présence de l’inhibiteur de la NA, le carboxylate d’oseltamivir. Vingt à 500 fois moins de cellules ont été infectées dans des cultures traitées contre des cultures non traitées (P < 0,0001) 7 h après l’application du virus, ce qui indique que le médicament a supprimé l’initiation de l’infection. Ces données démontrent que la NA virale joue un rôle au début de l’infection, et elles fournissent une justification supplémentaire pour l’utilisation prophylactique des inhibiteurs de la NA.
On pense que la fonction principale de la neuraminidase virale (NA) est au stade final de l’infection lorsque la NA clive l’acide sialique de la surface cellulaire et les virions descendants facilitant la libération du virus des cellules infectées (1, 2). On en sait moins sur les fonctions NA lors de l’entrée du virus dans la cellule. On a longtemps supposé que la NA favorise l’accès du virus aux cellules cibles des voies respiratoires par dégradation du mucus (3). Cependant, ce concept n’a jamais été formellement prouvé en raison de l’absence d’un système expérimental adéquat. De plus, certaines preuves contestant le rôle de l’AN aux premiers stades de l’infection ont été rapportées (examinées dans la référence 2).
Pour résoudre ce problème, nous avons étudié les effets du carboxylate d’oseltamivir (OC) (9), inhibiteur du NA, sur l’entrée du virus de la grippe dans des cultures d’épithélium des voies respiratoires humaines. Les cellules épithéliales trachéo-bronchiques humaines primaires (HTBE; Clonétique) et les cellules épithéliales nasales primaires (PromoCell GmbH) ont été cultivées sur des supports membranaires (Transwell-Clear de 12 mm; Corning, Inc.) à l’interface air-liquide dans un milieu sans facteur de croissance sérique et avec supplément d’hormones (6, 8). Des cultures entièrement différenciées de 4 à 8 semaines ont été utilisées pour toutes les expériences. Ces cultures étaient pseudostratifiées et polarisées; contenaient des cellules basales, ciliées et sécrétant du mucus; et ressemblaient étroitement à l’épithélium des voies respiratoires humaines in vivo (Fig. 1). De l’OC (1 µM, sauf indication contraire) a été ajouté aux suspensions de virus et aux compartiments basolatéraux des cultures peu de temps avant d’infecter deux cultures répliquées du côté apical. Deux cultures témoins ont été infectées en l’absence d’inhibiteur. Une heure après l’infection, nous avons retiré l’inoculum viral et incubé des cultures à l’interface air-liquide pendant 6 h supplémentaires pour permettre la réplication intracellulaire du virus. Les cultures ont ensuite été fixées et les cellules infectées ont été identifiées par coloration avec des antisérums polyclonaux sur des virus entiers suivie d’anticorps secondaires marqués par la peroxydase (Dianova) et d’un substrat d’aminoéthylcarbazole (Sigma) correspondants. Une coloration positive indique une entrée réussie du virus dans la cellule. Les cultures ont été analysées en face à un grossissement de ×300 (Olympus IMT-2). Un nombre total de cellules exprimant l’antigène viral a été compté dans le segment épithélial qui comprenait toutes les vues microscopiques consécutives (0,28 par 0,42 mm) le long du diamètre de la culture (surface du segment, 3 mm2; nombre de cellules par segment, environ 30 000). Quatre segments par culture ont été comptés en faisant pivoter la culture de 45o dans le sens des aiguilles d’une montre. Les données pour huit segments de deux cultures répliquées ont été moyennées.
Dans deux expériences utilisant des cultures HTBE, le virus humain A/Memphis/14/96 (H1N1) a infecté 22 et 65 fois moins de cellules en présence d’inhibiteur de NA par rapport aux témoins (Fig. 2; Tableau 1) (P < 0,0001). Les virus A/Duck/Alberta/119/98 (H1N1) provenant d’un oiseau aquatique sauvage et A/Turkey/Italy/2379/99 (H7N1) provenant de volailles domestiques étaient également très sensibles au CO dans ces cultures. Dans les cultures épithéliales nasales, l’OC a réduit l’infection par le virus humain et le virus du canard de 120 et 520 fois, respectivement. Ces résultats indiquent que l’inhibition de la NA virale supprime l’initiation de l’infection virale.
A/Chicken/Germany / R28/03 (H7N7) appartient à la lignée du virus de la grippe aviaire hautement pathogène qui a provoqué une épidémie de peste aviaire dans les élevages de volailles commerciaux aux Pays-Bas, en Belgique et en Allemagne en 2003. Ces virus ont été transmis à au moins 89 humains, dont la plupart présentaient une conjonctivite, mais un cas mortel de pneumonie s’est également produit (5). L’infection par le virus H7N7 du poulet dans les cultures HTBE a été réduite de 140 et 40 fois en présence de 1 et 0,1 µM d’OC, respectivement. Ces concentrations représentaient les concentrations plasmatiques maximales et minimales typiques du médicament atteintes chez l’homme après l’administration de 75 mg de phosphate d’oseltamivir, la dose recommandée pour la prophylaxie (9).
Pour confirmer l’hypothèse selon laquelle l’inhibition de l’infection dans nos expériences était directement liée à l’inhibition de l’activité enzymatique du NA viral, nous avons utilisé un A/Sydney humain/5/97- comme le virus (H3N2) et son mutant résistant à l’oseltamivir avec une substitution R292K dans le NA, ce qui rend le NA 9 000 fois moins sensible à l’inhibition par OC (4). Conformément à l’hypothèse, le virus humain parent était fortement inhibé par l’OC, alors que seul un niveau marginal d’inhibition du mutant résistant a été observé lorsque les deux virus ont été testés dans la même expérience dans des cultures HTBE (tableau 1). Jusqu’à présent, aucun test de culture cellulaire adéquat n’était disponible pour surveiller la résistance du virus de la grippe aux inhibiteurs de NA en raison de l’inadéquation entre les récepteurs de l’acide sialique chez l’homme et dans les lignées cellulaires conventionnelles de laboratoire (9, 11). Nos résultats suggèrent que des cultures différenciées d’épithélium des voies respiratoires humaines pourraient être un système de culture cellulaire approprié pour la détection de la résistance du virus de la grippe aux inhibiteurs de NA.
Enfin, en utilisant le médicament sensible A / Sydney/5/97- comme le virus, nous avons testé l’inhibition de l’infection par l’OC ajouté à différents moments après l’inoculation du virus. Alors que 47 fois moins de cellules ont été infectées lorsque le médicament a été ajouté peu de temps avant l’infection, un retard de 1 h en plus de l’OC n’a entraîné qu’une inhibition de 1,5 fois par rapport au témoin non traité (tableau 1). Si le médicament a été ajouté 4 h après l’inoculation du virus, aucune inhibition statistiquement significative n’a été observée. Ces données suggèrent que le CO a affecté les premiers stades de l’infection précédant la réplication du virus.
En résumé, nous avons fourni ici pour la première fois des preuves expérimentales directes du rôle essentiel de la NA au stade de l’invasion virale de l’épithélium cilié des voies respiratoires humaines. La fonction NA à ce stade est très probablement l’élimination des récepteurs de leurre sur les mucines, les cils et le glycocalix cellulaire, une forte liaison à chacun d’eux entraverait l’accès du virus aux récepteurs fonctionnels sur la membrane de surface des cellules cibles. Cependant, d’autres fonctions de la NA — par exemple, la promotion de la fusion médiée par l’hémagglutinine (7) – ne peuvent être exclues, et des études supplémentaires sont nécessaires pour spécifier les mécanismes exacts par lesquels la NA favorise l’entrée du virus dans les cellules épithéliales des voies respiratoires.
Aucun vaccin n’étant encore disponible contre les virus de l’influenza aviaire hautement pathogènes H7N7 et H5N1, les médicaments antiviraux restent la seule option pour lutter contre la grippe aviaire (10). Comparés à d’autres agents anti-grippaux, les inhibiteurs de NA sont bien tolérés et efficaces contre toutes les souches de virus grippaux A et B. Il y a eu peu de preuves de l’émergence d’une résistance virale, et l’infectiosité des virus mutants est généralement compromise (9, 11). La capacité des inhibiteurs de NA à supprimer l’infection avant l’entrée du virus dans les cellules souligne leur potentiel élevé de mesures préventives. En particulier, nos données fournissent la base scientifique pour soutenir l’utilisation prophylactique de ces composés chez les personnes à haut risque d’infection par les virus de la grippe aviaire.
