Le test TUNEL est le plus couramment utilisé pour détecter les cellules en apoptose, qui est une forme de mort cellulaire programmée. L’apoptose est un processus biologique important au cours du développement et pour le maintien de l’homéostasie tissulaire. La coloration TUNEL permet la visualisation et la quantification des cellules apoptotiques. Cela aide les scientifiques à tester l’efficacité de nouveaux traitements pour les troubles dans lesquels l’apoptose est inhibée, comme dans le cancer, ou améliorée, comme dans la neurodégénérescence.
Cette vidéo expliquera comment le test TUNEL peut être utilisé pour marquer des cellules en apoptose, un protocole étape par étape pour effectuer cette méthode dans des coupes de tissus, et comment les chercheurs appliquent cette technique pour comprendre les mécanismes de la mort cellulaire.
Avant d’approfondir le protocole du test TUNEL, discutons des principes de cette technique.
L’une des nombreuses caractéristiques distinctives de l’apoptose est la fragmentation de l’ADN. Comment se produit la fragmentation de l’ADN? L’apoptose est réalisée par des enzymes appelées caspases présentes dans le cytosol. Leur rôle principal est de cliver les protéines afin de démanteler la cellule. De plus, les caspases activent une enzyme appelée DNase activée par la caspase, ou CAD, en la détachant de son inhibiteur — ICAD. La CAD activée est une endonucléase qui se déplace vers le noyau et clive l’ADN chromosomique.
Le clivage de l’ADN provoque finalement une accumulation de fragments d’ADN avec des extrémités entaillées, et le test TUNEL marque de manière fluorescente ces extrémités entaillées de l’ADN fragmenté, permettant aux scientifiques de détecter l’apoptose. Mais comment cela se produit-il? Pour cela, vous devez comprendre la réaction de TUNEL. TUNEL est l’acronyme de dUTP nick-end labeling à médiation par la désoxynucléotidyl transférase terminale. Les deux principaux réactifs TUNEL sont la désoxynucléotidyl transférase terminale, ou TdT, et la désoxyuridine triphosphate, ou dUTP, qui peut être marquée par fluorescence pour faciliter la détection.
Pour comprendre la réaction de TUNEL, revenons aux cellules apoptotiques avec des fragments d’ADN. Ces fragments entaillés ont des groupes hydroxyle 3′ libres. Une fois que vous ajoutez les réactifs TUNEL à un échantillon contenant des cellules apoptotiques, les dUTP marqués par fluorescence se fixent à ces groupes hydroxyles 3 ‘ à l’aide de l’enzyme catalytique TdT. Les cellules colorées à l’aide de cette procédure sont appelées cellules positives de TUNEL, qui peuvent ensuite être visualisées à l’aide de la microscopie à fluorescence.
Maintenant que vous comprenez les principes et concepts de base du test TUNEL, décrivons un protocole général pour effectuer cette technique dans des coupes de tissus. Les principales étapes du test TUNEL comprennent la fixation du tissu d’intérêt, la perméabilisation du tissu, l’ajout de réactifs TUNEL, l’arrêt de la réaction TUNEL et enfin l’analyse.
Tout d’abord, le tissu d’intérêt doit être fixé afin de préserver les structures biologiques. La fixation fonctionne en réticulant les protéines à l’intérieur des cellules. Pour le test TUNEL, les tissus peuvent être fixés en les ajoutant à une solution contenant 4% de paraformaldéhyde pendant 4 à 24 heures à 4 ° C. Après fixation, cryosection du tissu en fines tranches de 10 µm ou moins.
L’étape suivante est la perméabilisation, qui permet à des réactifs tels que l’enzyme TdT de pénétrer dans le noyau cellulaire. La perméabilisation des sections de tissu peut être effectuée en ajoutant le tissu à une solution de protéinase K pendant 5 à 15 minutes à 37 ° C. Rincer les sections de tissu avec une solution saline tamponnée au phosphate sur un agitateur orbital pendant 15 à 30 minutes à température ambiante.
Après la perméabilisation, l’enzyme TdT et les dUTP marqués par fluorescence sont ajoutés aux sections tissulaires, ainsi qu’un tampon de marquage contenant du cobalt qui agit comme cofacteur pour la réaction de TUNEL. Ensemble, le mélange réactionnel TUNEL et la section de tissu sont incubés pendant 1 à 3 heures à 37 ° C et protégés de la lumière pour empêcher la fluorescence de s’estomper.
Après l’incubation, du tampon stop est ajouté à la section tissulaire pour arrêter la réaction de TUNEL, et après une courte incubation, les sections sont lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate. Enfin, les coupes de tissus colorées à l’aide de dUTP marqués de manière fluorescente sont visualisées à l’aide de la microscopie à fluorescence et évaluées pour la localisation des cellules positives de TUNEL dans un tissu donné. On peut quantifier la mort cellulaire simplement en comptant le pourcentage de cellules positives de TUNEL dans une section de tissu donnée.
Maintenant que vous avez vu comment effectuer le test TUNEL pour détecter les cellules apoptotiques, discutons de la façon dont ce test peut être utilisé pour répondre aux questions posées par les biologistes cellulaires.
La mort cellulaire se produit comme une partie normale du développement pour la sculpture des tissus et des structures, et pour l’élimination des cellules inutiles. Par conséquent, les scientifiques intéressés par ce phénomène étudient l’effet de l’exposition prénatale à différentes substances sur l’apoptose au cours du développement. Ici, les scientifiques se sont intéressés à examiner l’effet de l’exposition prénatale à l’alcool sur le développement du cerveau. Les résultats de la coloration de TUNEL effectuée sur les cerveaux fœtaux ont révélé une apoptose accrue dans les tissus exposés à l’alcool avant la naissance, par rapport aux animaux témoins.
Les scientifiques utilisent également le test TUNEL pour étudier l’apoptose en réponse à une infection bactérienne. Dans cette expérience, les scientifiques ont développé un modèle de pneumonie en injectant à des souris Pseudomonas aeruginosa, qui induit une inflammation pulmonaire. Ensuite, du tissu pulmonaire a été prélevé et une coloration au TUNEL a été réalisée pour examiner l’apoptose en réponse à l’infection bactérienne. Les résultats montrent que la mort cellulaire apoptotique a augmenté chez les souris exposées à la bactérie, par rapport aux animaux témoins.
Enfin, la coloration TUNEL peut être utilisée sur des échantillons de tumeurs humaines, afin de déterminer la réactivité tumorale aux médicaments. Dans cet exemple, des échantillons tumoraux ont été prélevés sur des patients humains et cultivés ex vivo. Ensuite, ils ont été traités avec des médicaments précliniques et évalués pour une réponse à l’aide du test TUNEL. Les données obtenues montrent que le traitement avec un médicament qui inhibe la protéine de choc thermique 90 augmente considérablement l’apoptose dans le tissu tumoral.
Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur l’utilisation du test TUNEL pour détecter les cellules en apoptose. Cette vidéo a passé en revue les principes de la coloration TUNEL et un protocole étape par étape pour effectuer le test TUNEL sur des coupes de tissus. Nous avons également examiné comment cette méthode pourrait être appliquée pour comprendre la mort cellulaire programmée pendant le développement et la maladie. Comme toujours, merci d’avoir regardé!
