Méthodes de Purification des Protéines: 4 Méthodes

Cet article met en lumière les quatre méthodes de purification des protéines.

Les quatre méthodes de purification des protéines sont: (1) L’Extraction (2) La Précipitation et la Solubilisation Différentielle (3) l’Ultracentrifugation et (4) Les Méthodes Chromatographiques.

Les méthodes utilisées dans la purification des protéines peuvent être grossièrement divisées en méthodes analytiques et préparatives.

La distinction n’est pas exacte, mais le facteur décisif est la quantité de protéines, qui peut pratiquement être purifiée avec cette méthode. Les méthodes analytiques visent à détecter et à identifier une protéine dans un mélange, tandis que les méthodes préparatives visent à produire de grandes quantités de la protéine à d’autres fins, telles que la biologie structurale ou l’utilisation industrielle. En général, les méthodes de préparation peuvent être utilisées dans des applications analytiques, mais pas l’inverse.

Méthode #1. Extraction:

Selon la source, la protéine doit être mise en solution en cassant le tissu ou les cellules qui la contiennent. Il existe plusieurs méthodes pour y parvenir; Congélation et décongélation répétées, sonication, homogénéisation par haute pression ou perméabilisation par des solvants organiques. La méthode de choix dépend de la fragilité de la protéine et de la solidité des cellules.

Après ce processus d’extraction, la protéine soluble sera dans le solvant et pourra être séparée des membranes cellulaires, de l’ADN, etc. par centrifugation. Le processus d’extraction extrait également des protéases, qui commenceront à digérer les protéines dans la solution. Si la protéine est sensible à la protéolyse, il est généralement souhaitable de procéder rapidement et de maintenir l’extrait refroidi pour ralentir la protéolyse.

Méthode #2. Précipitation et solubilisation différentielle:

Dans la purification des protéines en vrac, une première étape courante pour isoler les protéines est la précipitation avec du sulfate d’ammonium (NH4) 2SO4. Ceci est réalisé en ajoutant des quantités croissantes de sulfate d’ammonium et en collectant les différentes fractions de protéines précipitées. Un avantage de cette méthode est qu’elle peut être réalisée à peu de frais avec de très gros volumes.

Les premières protéines à purifier sont des protéines solubles dans l’eau. La purification des protéines membranaires intégrales nécessite une perturbation de la membrane cellulaire afin d’isoler une protéine particulière des autres qui se trouvent dans le même compartiment membranaire. Parfois, une traction membranaire particulière peut être isolée en premier, comme isoler les mitochondries des cellules avant de purifier une protéine située dans une membrane mitochondriale.

Un détergent tel que le dodécylsulfate de sodium (SDS) peut être utilisé pour dissoudre les membranes cellulaires et maintenir les protéines membranaires en solution pendant la purification; cependant, comme le SDS provoque une dénaturation, des détergents plus doux tels que le Triton X-100 ou CHAPS peuvent être utilisés pour conserver la conformation native de la protéine pendant la purification.

Méthode #3. Ultracentrifugation:

La centrifugation est un processus qui utilise la force centrifuge pour séparer des mélanges de particules de masses ou de densités variables en suspension dans un liquide. Lorsqu’un récipient (généralement un tube ou une bouteille) contenant un mélange de protéines ou d’autres particules, telles que des cellules bactériennes, est tourné à des vitesses élevées, le moment cinétique produit une force extérieure à chaque particule proportionnelle à sa masse.

La tendance d’une particule donnée à se déplacer dans le liquide à cause de cette force est compensée par la résistance que le liquide exerce sur la particule. L’effet net de la « rotation » de l’échantillon dans une centrifugeuse est que les particules massives, petites et denses se déplacent plus rapidement vers l’extérieur que les particules moins massives ou les particules avec plus de « traînée » dans le liquide.

Lorsque des suspensions de particules sont « filées » dans une centrifugeuse, une « pastille » peut se former au fond du récipient qui est enrichie pour les particules les plus massives à faible traînée dans le liquide. Les particules restantes non compactées restant encore pour la plupart dans le liquide sont appelées « surnageant » et peuvent être retirées du récipient pour séparer le surnageant de la pastille.

La vitesse de centrifugation est spécifiée par l’accélération angulaire appliquée à l’échantillon, généralement mesurée par rapport au g. Si les échantillons sont centrifugés suffisamment longtemps, les particules dans le récipient atteindront l’équilibre dans lequel les particules s’accumulent spécifiquement à un point du récipient où leur densité de flottabilité est équilibrée avec la force centrifuge. Une telle centrifugation « à l’équilibre » peut permettre une purification étendue d’une particule donnée.

Centrifugation par gradient de saccharose:

Un gradient de concentration linéaire de sucre (généralement du saccharose glycérol, ou Percoll) est généré dans un tube de sorte que la concentration la plus élevée se trouve en bas et la plus faible en haut. Un échantillon de protéines est ensuite superposé au-dessus du gradient et filé à grande vitesse dans une ultracentrifugeuse. Cela fait migrer les macromolécules lourdes vers le fond du tube plus rapidement que les matériaux plus légers.

Pendant la centrifugation en l’absence de saccharose, à mesure que les particules s’éloignent de plus en plus du centre de rotation, elles subissent de plus en plus de force centrifuge (plus elles se déplacent, plus elles se déplacent rapidement). Le problème avec cela est que la plage de séparation utile dans le navire est limitée à une petite fenêtre observable.

Faire tourner un échantillon deux fois plus longtemps ne signifie pas que la particule d’intérêt ira deux fois plus loin; en fait, elle ira beaucoup plus loin. Cependant, lorsque les protéines se déplacent à travers un gradient de saccharose, elles rencontrent un liquide de densité et de viscosité croissantes.

Un gradient de saccharose correctement conçu neutralisera la force centrifuge croissante, de sorte que les particules se déplacent en proportion étroite du temps qu’elles ont passé dans le champ centrifuge. Les échantillons séparés par ces gradients sont appelés centrifugations « zonales à taux ». Après séparation des protéines/particules, le gradient est ensuite fractionné et collecté.

Méthode #4. Méthodes Chromatographiques:

Habituellement, un protocole de purification des protéines contient une ou plusieurs étapes chromatographiques. La procédure de base en chromatographie consiste à faire circuler la solution contenant la protéine à travers une colonne remplie de divers matériaux. Différentes protéines interagissent différemment avec le matériau de la colonne, et peuvent ainsi être séparées par le temps nécessaire pour passer la colonne, ou les conditions requises pour éluer la protéine de la colonne. Habituellement, les protéines sont détectées lorsqu’elles sortent de la colonne par leur absorbance à 280 nm.

Il existe de nombreuses méthodes chromatographiques différentes :

1. Chromatographie d’exclusion de taille:

La chromatographie peut être utilisée pour séparer les protéines en solution ou dans des conditions de dénaturation en utilisant des gels poreux. Cette technique est connue sous le nom de chromatographie d’exclusion de taille. Le principe est que les molécules plus petites doivent traverser un volume plus important dans une matrice poreuse. Par conséquent, les protéines d’une certaine taille nécessiteront un volume variable d’éluant (solvant) avant d’être collectées à l’autre extrémité de la colonne de gel.

Dans le cadre de la purification des protéines, l’éluant est généralement mis en commun dans différents tubes à essai. Tous les tubes à essai ne contenant aucune trace mesurable de la protéine à purifier sont jetés. La solution restante est donc constituée de la protéine à purifier et de toute autre protéine de taille similaire.

2. Chromatographie par échange d’ions:

La chromatographie par échange d’ions sépare les composés en fonction de la nature et du degré de leur charge ionique. La colonne à utiliser est sélectionnée en fonction de son type et de sa force de charge. Les résines échangeuses d’anions ont une charge positive et sont utilisées pour retenir et séparer les composés chargés négativement, tandis que les résines échangeuses de cations ont une charge négative et sont utilisées pour séparer les molécules chargées positivement.

Avant le début de la séparation, un tampon est pompé à travers la colonne pour équilibrer les ions chargés opposés. Lors de l’injection de l’échantillon, les molécules de soluté échangeront avec les ions tampons car chacune est en compétition pour les sites de liaison sur la résine. La durée de rétention de chaque soluté dépend de la force de sa charge.

Les composés les plus faiblement chargés éluteront en premier, suivis de ceux avec des charges successivement plus fortes. En raison de la nature du mécanisme de séparation, le pH, le type de tampon, la concentration du tampon et la température jouent tous des rôles importants dans le contrôle de la séparation. La chromatographie par échange d’ions est un outil très puissant pour la purification des protéines et est fréquemment utilisée dans les séparations analytiques et préparatives.

3. Chromatographie d’Affinité:

La chromatographie d’affinité est une technique de séparation basée sur la conformation moléculaire, qui utilise fréquemment des résines spécifiques à l’application. Ces résines ont des ligands attachés à leurs surfaces qui sont spécifiques des composés à séparer. Le plus souvent, ces ligands fonctionnent de manière similaire à celle des interactions anticorps-antigène. Cet ajustement « clé et serrure » entre le ligand et son composé cible le rend très spécifique, générant fréquemment un seul pic, alors que tout le reste de l’échantillon n’est pas retenu.

De nombreuses protéines membranaires sont des glycoprotéines et peuvent être purifiées par chromatographie d’affinité de lectine. On peut laisser les protéines solubilisées dans un détergent se lier à une résine de chromatographie qui a été modifiée pour avoir une lectine attachée de manière covalente.

Les protéines qui ne se lient pas à la lectine sont éliminées, puis des glycoprotéines spécifiquement liées peuvent être éluées en ajoutant une forte concentration d’un sucre en concurrence avec les glycoprotéines liées au site de liaison de la lectine. Certaines lectines ont une liaison d’affinité élevée aux oligosaccharides de glycoprotéines difficiles à concurrencer les sucres, et les glycoprotéines liées doivent être libérées en dénaturant la lectine.

4. Liaison métallique:

Une technique courante consiste à concevoir une séquence de 6 à 8 histidines dans la C-terminale de la protéine. La polyhistidine se lie fortement aux ions métalliques divalents tels que le nickel et le cobalt. La protéine peut être passée à travers une colonne contenant des ions nickel immobilisés, qui lie l’étiquette polyhistidine. Toutes les protéines non marquées traversent la colonne.

La protéine peut être éluée avec de l’imidazole, qui est en concurrence avec l’étiquette polyhistidine pour se lier à la colonne, ou par une diminution du pH (typiquement à 4,5), ce qui diminue l’affinité de l’étiquette pour la résine. Bien que cette procédure soit généralement utilisée pour la purification de protéines recombinantes avec une étiquette d’affinité machinée (telle qu’une étiquette 6xHis ou une étiquette HAT de Clontech), elle peut également être utilisée pour des protéines naturelles avec une affinité inhérente aux cations divalents.

5. Chromatographie d’immunoaffinité:

La chromatographie d’immunoaffinité utilise la liaison spécifique d’un anticorps à la protéine cible pour purifier sélectivement la protéine. La procédure consiste à immobiliser un anticorps sur un matériau de colonne, qui se lie ensuite sélectivement à la protéine, tandis que tout le reste circule. La protéine peut être éluée en modifiant le pH ou la salinité. Parce que cette méthode n’implique pas d’ingénierie dans une étiquette, elle peut être utilisée pour des protéines de sources naturelles.

6. HPLC:

La chromatographie en phase liquide à haute performance ou la chromatographie en phase liquide à haute pression est une forme de chromatographie appliquant une pression élevée pour conduire les solutés à travers la colonne plus rapidement. Cela signifie que la diffusion est limitée et que la résolution est améliorée. La forme la plus courante est la CLHP « phase inversée », où le matériau de la colonne est hydrophobe.

Les protéines sont éluées par un gradient de quantités croissantes d’un solvant organique, tel que l’acétonitrile. Les protéines éluent en fonction de leur hydrophobie. Après purification par CLHP, la protéine est dans une solution qui ne contient que des composés volatils, et peut facilement être lyophilisée. La purification par CLHP entraîne fréquemment une dénaturation des protéines purifiées et n’est donc pas applicable aux protéines qui ne se replient pas spontanément.