PMC

1 Des protocoles détaillés et des conseils de dépannage pour tous les aspects du système d’expression des protéines de fusion de gènes GST sont disponibles auprès de GE Healthcare dans les manuels: Système de fusion de gènes GST, numéro de produit 18-1157-58, et Le Manuel sur les protéines recombinantes, numéro de produit 18-1142-75. Les manuels sont disponibles à l’achat en version papier ou peuvent être consultés au format PDF sur le site Web de GE Healthcare.

2l’utilisation de JM105 ou d’une souche similaire est recommandée pour le clonage et le maintien du vecteur. Les souches de BL21 et de ses dérivés, ou une autre souche déficiente en protéase, sont recommandées pour une expression maximale des protéines. Les souches déficientes en produits du gène de la protéase cytoplasmique tels que lon, ompT, degP ou htpR peuvent minimiser les effets de la dégradation protéolytique de la protéine surexprimée par l’hôte. N’utilisez pas une souche d’E. coli portant l’allèle rec1A pour propager les plasmides pGEX, car des délétions ou des réarrangements de l’ADN plasmidique ont été rapportés.

3glutathion Sépharose 4B un milieu en vrac est utilisé dans ce protocole de purification. Ce support de chromatographie est idéal pour les conditions de criblage et permet une mise à l’échelle facile. Les purifications sont effectuées facilement à l’aide d’un flux gravitaire ou d’un système de chromatographie à basse pression, ou peuvent être utilisées dans des purifications par lots basées sur la centrifugation. Les colonnes d’affinité GSTrap FF sont des colonnes préemballées de 1 ml ou 5 ml qui sont également disponibles et peuvent être connectées en série pour une mise à l’échelle. Ces colonnes sont destinées à être utilisées avec un système de chromatographie liquide, une pompe ou une seringue. En plus de ces formats, le glutathion sépharose est également disponible en colonnes de spin et en formats de plaques à 96 puits pour un criblage rapide des conditions d’expression et de purification des protéines de fusion GST.

La 4DFP est une neurotoxine extrêmement dangereuse. Suivez les précautions fournies par le fabricant et ne manipulez le réactif pur que dans une hotte à fumée chimique.

5l’ajout d’inhibiteurs de protéase au tampon de lyse aidera à prévenir la dégradation protéolytique de la protéine cible lors de l’extraction. Cependant, le cocktail exact d’inhibiteurs de protéase ajoutés au tampon de lyse doit être adapté aux caractéristiques de la protéine cible. Des agents réducteurs tels que le 2-ME, le DTT ou le TCEP à des concentrations de 1 à 10 mM doivent être ajoutés au tampon au besoin. L’ajout d’un détergent non ionique, tel que 1% de Triton X-100, peut également être ajouté au tampon pour faciliter l’extraction.

6suivant est un protocole de criblage pour vérifier les niveaux d’expression protéique de la protéine de fusion dans les mini-cultures. La présence d’une augmentation des niveaux de protéines au poids moléculaire attendu sur un gel SDS-PAGE après induction avec IPTG est une bonne indication de l’expression réussie des protéines. Après induction, une bande proéminente au poids moléculaire attendu (poids moléculaire de la protéine cible + ~ 26 KDa pour la fraction GST) devrait être visible. Si l’on soupçonne que la protéine est exprimée à un faible niveau, la vérification de l’expression correcte peut être effectuée en utilisant un Western blot avec un anticorps spécifique de la protéine cible ou de la GST. Si les échantillons ne sont pas immédiatement analysés par SDS-PAGE, ils peuvent être stockés pendant la nuit à 4 ° C ou à -20 ° C pour un stockage à plus long terme.

1. Inoculer plusieurs colonies isolées dans des tubes à centrifuger séparés de 50 ml contenant 10 ml de LB additionnés de 100 µg/ml d’ampicilline. Cultivez une culture pendant la nuit à 37 °C en secouant.

2. Le lendemain matin, ajoutez 0,5 ml de culture pendant la nuit à 4,5 ml de LB avec 100 µg / ml d’ampicilline. Cultiver 1 h à 37 °C.

3. Retirer 1 ml d’échantillon non induit. Centrifuger et éliminer le surnageant. Congelez ou conservez sur de la glace jusqu’à ce que vous soyez prêt à exécuter la PAGE SDS.

4. Ajouter l’IPTG à une concentration finale de 1 mM et faire pousser pendant 2-3 h supplémentaires.

5. Retirer 1 ml d’échantillon induit. Centrifuger et éliminer le surnageant. Congelez ou conservez sur de la glace jusqu’à ce que vous soyez prêt à exécuter la PAGE SDS.

6. Remettre les pastilles de cellules en suspension dans un tampon d’échantillon de 200 µl SDS-PAGE; chauffer 3-5 min à 90 °C.

7. Analyser 5 à 10 µl à l’aide de la PAGE SDS suivie d’une coloration au bleu de Coomassie (ou 1 à 2 µl pour le Western blot).

7des échantillons cultivés dans des mini-cultures peuvent également être utilisés pour évaluer la solubilité d’une protéine de fusion particulière (voir la note 6 pour le protocole d’expression de la mini-culture). À la fin de la période d’induction, récoltez les cellules par centrifugation. Remettre le culot en suspension dans 200 µl de PBS froid. Lyser les cellules en utilisant la sonication; garder l’échantillon sur la glace. Enregistrez une petite aliquote du lysat pour analyse par PAGE SDS. Centrifuger l’échantillon lysé pendant 15 min. Retirez le surnageant dans un tube séparé. Remettre la pastille en suspension dans 200 µl de PBS. Analyser une partie du lysat brut, du surnageant et de la pastille remise en suspension par SDS-PAGE ou Western blot. Si l’échantillon est observé à la fois dans la fraction lysat et surnageante, l’échantillon est suffisamment soluble. Si l’échantillon est présent principalement dans le lysat et le culot remis en suspension, l’échantillon est probablement dans les corps d’occlusion. Dans les cas où la protéine est située dans des corps d’inclusion, explorer différentes conditions d’expression pour déplacer l’expression vers une forme soluble (voir Note 8).

8Si la protéine de fusion est exprimée principalement dans les corps d’inclusion (p. ex. > 80% insoluble), diverses stratégies peuvent être utilisées pour améliorer la solubilité. Souvent, l’induction à une température plus basse (15-25 ° C) est efficace pour déplacer l’expression des corps d’inclusion vers la fraction soluble. Les cellules induites à cette température plus basse se développeront plus lentement et nécessiteront des périodes d’induction pendant la nuit. L’utilisation de souches hôtes alternatives ou des modifications de la construction plasmidique peuvent être nécessaires dans certains cas. Si la protéine de fusion reste principalement dans les corps d’inclusion même après des tentatives d’obtention de protéines solubles, il peut être intéressant d’augmenter la production de E. coli et purifier suffisamment de protéines à partir de la petite quantité de protéines solubles disponibles. Dans certains cas, d’autres étiquettes de protéines de fusion devraient être explorées.

9 Les faibles niveaux d’expression des protéines pourraient être le résultat d’une utilisation rare de codon. Dans ce cas, le passage à une autre souche d’E. coli qui contient des transcrits supplémentaires pour un ARNt de codon rare peut améliorer considérablement la production de protéines. Différentes formulations de milieux ou l’addition de glucose jusqu’à 2% peuvent également améliorer l’expression (13, 14). Si l’on soupçonne que la protéine exprimée est toxique pour les cellules (généralement elles cesseront de croître après l’induction avec l’IPTG), essayez d’induire à un moment ultérieur pendant une période plus courte. La diminution de la concentration de l’IPTG est une autre option qui devrait être explorée.

10Monitor la croissance cellulaire en lisant la densité optique à 600 nm (A600). Une culture de nuit devrait atteindre un A600 ~ 1-1.2. Les cellules doivent être induites à une phase précoce de la courbe de croissance logarithmique pour E. coli, A600 ~ 0,5 à 0,7. À 37 °C, il faudra environ 2 h pour que les cultures atteignent un stade de croissance précoce. Si les cellules sont cultivées à une température plus basse, le temps d’incubation doit être augmenté, car les cellules se développeront plus lentement à des températures plus basses. Généralement, le plus grand rendement en protéine de fusion sera obtenu lorsque les cellules sont induites à A600 = ~ 0,5. Après l’induction avec IPTG, une directive générale pour le temps d’incubation est la suivante: 3 h à 37 ° C, 5 h à 30 ° C et une nuit à 25 ° C ou moins. Récoltez les cellules avant la saturation, A600 ~ 1,0-1,2.

11pour assurer une aération adéquate, les flacons ne doivent être remplis qu’à 20-30% de leur capacité.

12Il est important qu’aucun inhibiteur de la sérine protéase ne soit présent dans l’échantillon avant le clivage avec la thrombine ou le facteur Xa. Les inhibiteurs de protéase suivants doivent être éliminés avant le clivage de la thrombine ou du facteur Xa: AEBSF, APMSF, antithrombine III, antipaïne, α1-antitrypsine, aprotinine, chymostatine, hirudine, leupeptine et PMSF. De plus, Pefabloc TH benzamidine est spécifique de la thrombine et Pefabloc FXa est spécifique du facteur Xa. Les inhibiteurs de protéase suivants doivent être évités avec la Protéase de prescription: 100 mm de ZnCl2, 100 µM de chymostatine et 4 mm de Pefabloc.

13il existe un certain nombre de méthodes alternatives de détection des protéines de fusion GST. Pour les protéines qui s’expriment bien à un niveau élevé, la méthode la plus simple de surveillance de la purification consiste à utiliser des gels SDS-PAGE colorés avec une tache bleue ou argentée de Coomassie. Une alternative pour les protéines qui s’expriment à de faibles niveaux est d’utiliser le Western blot en utilisant un anticorps dirigé contre la GST ou la protéine cible. Une alternative pour les expressions à petite échelle consiste à surveiller la présence de TPS avec un test enzymatique ELISA ou CDNB.

14enregistrez une petite quantité d’échantillon de protéines à chaque étape de la purification, y compris la lyse, le surnageant, les granulés, les fractions non liées du chargement de l’échantillon, les étapes de lavage et les étapes d’élution à analyser par PAGE SDS ou Western blot. Une fois que tous les échantillons ont été analysés et regroupés, jetez les fractions indésirables.

Les protéines 15GST peuvent également être purifiées à l’aide d’une méthode de purification par lots. Une méthode de purification par lots est rapide, facile et nécessite peu d’équipement; cependant, la protéine résultante peut contenir plus d’impuretés et avoir un rendement inférieur à celui d’une purification par chromatographie. Les purifications par lots sont mieux utilisées lors du criblage des conditions de purification. La purification par lots décrite ci-dessous est généralement effectuée à température ambiante. Pour minimiser le risque de dégradation protéolytique, la procédure peut être effectuée à 4 ° C en multipliant le temps d’incubation de 2 à 4 fois.

1. Lyser les cellules et obtenir une protéine de fusion soluble (voir les notes 8 et 21 si l’échantillon se trouve dans des corps d’inclusion).

2. Ajouter 2 ml de matrice en vrac de glutathion sépharose à 50% de suspension (volume de lit de 1 ml) par surnageant de lysat bactérien de 100 ml. Incuber 30 min à température ambiante sous agitation douce.

3. Centrifuger 500 × g pendant 5 min. Retirez le surnageant et enregistrez-le pour analyse par PAGE SDS afin de déterminer l’efficacité de la liaison.

4. Laver la résine avec 10 volumes de lit PBS. Remettre doucement en suspension, puis centrifuger 500 × g pendant 5 min. Retirez le surnageant. Répétez les étapes de lavage et de centrifugation pour un total de 3 lavages de 10 volumes de lit chacun.

5. Éluer la protéine de fusion en remuspendant la résine avec 1,0 ml de tampon d’élution du glutathion par ml de volume de lit. Incuber 10 min à température ambiante. Centrifuger 500 × g pendant 5 min. Transférer le surnageant contenant des protéines de fusion dans un tube séparé. Répétez les étapes d’élution et de collecte 3 fois au total. Les surnageants peuvent être regroupés ou analysés séparément par SDS-PAGE pour surveiller la teneur en protéines (voir Note 12).

Le volume du lit 16A est égal à la moitié de la suspension à 50% de glutathion Sépharose 4B utilisée pour la purification. Pour préparer une suspension à 50% de glutathion Sépharose (elle est fournie sous forme de suspension à ~ 75%): Déterminer le volume de lit requis pour l’échelle de purification. Remettre en suspension le glutathion Sépharose 4B. Pour chaque ml de volume de lit requis, pipeter 1,33 ml de la suspension à 75% dans un tube à centrifuger de taille appropriée. Centrifuger à 500 × g pendant 5 min. Décanter le super. Laver avec 10 volumes de lit (10 ml pour 1,33 ml de suspension d’origine) de PBS en inversant doucement le tube plusieurs fois pour mélanger, puis centrifuger 500 × g pendant 5 min. Décanter le super. Le fait de ne pas retirer la solution de stockage d’éthanol peut interférer avec les étapes de liaison ultérieures. Ajouter 1 ml de PBS pour chaque 1,33 ml de suspension d’origine. Il en résulte une suspension de 50%.

17le glutathion sépharose a une capacité de liaison minimale annoncée de 8 mg / ml. Une colonne de 20 ml doit être suffisante pour purifier les protéines provenant de cultures d’E. coli de 3 × 600 ml contenant environ 20 à 40 mg de protéines de fusion par culture. La quantité de résine utilisée et la taille de la colonne peuvent être augmentées ou réduites en fonction de la quantité de protéines à purifier.

18resuspendre la pastille à l’aide d’un tampon de lavage de 25 à 50 µl par ml de culture originale.

19la perturbation de la cellule est terminée lorsque la suspension se dégage partiellement et prend une couleur légèrement plus foncée. Évitez de mousser pendant la sonication, car cela peut entraîner une dénaturation de la protéine de fusion. Évitez la sursonication, car cela peut conduire à une co-purification des protéines de l’hôte E.coli avec la protéine de fusion GST. La viscosité élevée due à la libération d’acides nucléiques pendant la sonication peut être réduite en ajoutant de la DNase ou de la benzoase au tampon de lyse. Lysozyme jusqu’à une concentration de 0.2 mg / ml peuvent être ajoutés comme aide à la lyse cellulaire. Une alternative à la sonication est l’utilisation de formulations d’extraction cellulaire disponibles dans le commerce. Cependant, ces produits pourraient contenir des composants exclusifs qui interfèrent avec les applications en aval.

20Si les tentatives de déplacement de l’expression des corps d’inclusion vers la fraction soluble échouent, les protéines de fusion GST insolubles peuvent parfois être purifiées en présence de dénaturants tels que l’urée, suivies d’un refoulage. La solubilisation à l’aide de détergents tels que le sarkosyl (N-laurylsarosine) a également été utilisée avec succès (15, 16). Bien que le protocole suivant ait été utilisé avec succès pour dénaturer et re-naturaliser les protéines de fusion GST, chaque construction de protéine de fusion est unique et les conditions exactes de dénaturation et de renaturation doivent être déterminées empiriquement. Les dénaturants courants qui ont été utilisés avec succès comprennent la guanidine HCl, l’urée, le Tween 20, le CTAB et le SDS (17, 18). Les dénaturants doivent alors être complètement éliminés pour permettre un bon repliement de la protéine. Les conditions qui devraient être optimisées pour faciliter le refoulage comprennent: type de dénaturant, pH, présence d’agent réducteur, vitesse d’élimination du dénaturant et concentration en protéines. Une fois que la protéine a été re-naturalisée, vérifiez que la protéine a retrouvé sa conformation et sa fonction natives et éliminez toute protéine mal pliée.

1. Pré-équilibrer la colonne de glutathion Sépharose; soniquer les cellules d’E. coli granulées et séparer les fractions surnageantes de lysat et de granulés par centrifugation (voir 3.3 Purification d’affinité des étapes 1 à 8 de la protéine de fusion GST). Remettre en suspension la pastille de lysat qui comprend les corps d’inclusion, dans un tampon de lavage de 15 ml. Centrifuger 20 min à 48 000 ×g (4 °C). Décanter le surnageant et remettre en suspension le culot lavé dans 12 ml de tampon U (remettre en suspension dans 20 µl de tampon U par ml de culture originale). Incuber 2 h sur de la glace.

2. Centrifuger 20 min à 48 000 ×g (4 °C). Transférer le surnageant qui contient la protéine de fusion dénaturée dans un tube à centrifuger propre.

3. Ajouter le Triton X-100 au surnageant jusqu’à une concentration finale de 1%.

4. Dialyser l’échantillon dans du PBS / glycérol pendant 2-3 h. Le volume du tampon de dialyse doit être au moins 20 fois le volume de l’échantillon.

5. Dialyser l’échantillon pendant la nuit par rapport au PBS avec des inhibiteurs de protéase en utilisant un volume tampon > 100 fois le volume de l’échantillon.

6. Retirer l’échantillon de la dialyse et centrifuger 20 min à 4 000 × g.

7. Les protéines extraites et régénérées des corps d’inclusion peuvent maintenant être appliquées sur les colonnes de glutathion Sépharose et purifiées.

Solutions:

Tampon de lavage: 50 mm Tris, 5 mm EDTA, 1 µg / ml leupeptine, 1 µg / ml pepstatine, 0,15 mm PMSF, pH 8,0

Tampon U: 5 M urée, 50 mm Tris, 5 mm EDTA, 5 mm 2-ME, 1 µg / ml leupeptine, 1 µg / ml pepstatine, 0,15 mm PMSF, 1 mM DFP pH 8,0

PBS / glycérol: 1X PBS, 20% de glycérol, 1% de Triton X-100, 5 mm 2-ME, 5 mm EDTA, 5 mm 2-ME, 1 µg / ml de leupeptine, 1 µg / ml de pepstatine, 0,15 mm PMSF, 1 mm DFP pH 7,4

21l’utilisation d’une pompe péristaltique est conseillée pour contrôler uniformément les débits. En cas de compression de la résine, la pression est trop élevée et le débit doit être réduit.

22la cinétique de liaison entre le glutathion et la GST est relativement lente. Il est donc important d’utiliser des débits faibles pour atteindre une capacité de liaison maximale, par exemple 0,1 ml/ min pour une colonne d’identification de 2,5 cm. L’utilisation de débits trop rapides peut diminuer la quantité de protéines de fusion liées en raison de la cinétique d’association lente. Les étapes de lavage et d’élution peuvent être effectuées à des débits plus rapides pour gagner du temps (respectivement 1,5 ml/min et 0,3 ml/min). Pour les échantillons de gros volumes, la liaison est plus pratique pendant la nuit, avec des ajustements des débits afin que la colonne ne sèche pas.

23 L’analyse des fractions non liées indiquera si la protéine de fusion se lie ou non. Si la protéine n’est pas détectée dans les premières fractions mais apparaît dans les fractions ultérieures, cela indique que la capacité de la colonne a été dépassée. La réduction de la charge protéique ou l’augmentation de la taille de la colonne atténueront cette condition.

24Si la protéine de fusion se lie mal au glutathion sépharose, il existe plusieurs alternatives pour essayer d’augmenter l’efficacité de liaison. Essayez une méthode de lyse plus douce. Si la méthode utilisée est trop dure, la protéine peut devenir dénaturée et, par conséquent, incapable de se lier à la colonne. De plus, en cas de renaturation de la protéine à partir de corps d’inclusion, assurez-vous que tous les dénaturants ont été retirés du tampon, soit par dialyse exhaustive, soit par application de l’échantillon sur une colonne de dessalement, avant de l’appliquer sur la colonne de glutathion. Retirer la solution de stockage d’éthanol du glutathion Sépharose; réduire la colonne avec du tampon de glutathion frais suivi d’un lavage avec du PBS immédiatement avant le chargement de l’échantillon. Augmenter la quantité de résine et/ou diminuer le débit utilisé pour charger l’échantillon. Essayez d’ajouter 1-20 mm de TNT à l’échantillon. Si un problème persiste, nettoyez la colonne conformément aux recommandations du fabricant. Si la liaison n’est toujours pas rétablie, essayez d’utiliser de la résine fraîche.

25le rendement en protéine de fusion peut également être estimé en mesurant l’absorbance à 280 nm (A280). Le coefficient d’extinction pour la seule fraction GST est de ~ 1,5, soit 1,00 A280 = ~ 0.6 mg / ml de protéine, bien que le coefficient d’extinction de la protéine de fusion dépende en partie des caractéristiques d’absorbance de la protéine cible.

26Si il y a un problème pour éluer la protéine de la colonne de glutathion Sépharose, essayez de diminuer le débit et d’augmenter le volume de tampon d’élution utilisé. Assurez-vous d’utiliser un tampon de glutathion réduit frais (faites-en le jour où il sera utilisé). Augmenter la concentration de glutathion jusqu’à 40 mM et / ou augmenter le pH du tampon à pH 8,0–9,0. Ajouter 1-20 mm de TNT (ou autre agent réducteur) au tampon. L’ajout d’un détergent non ionique peut également améliorer la solubilisation et minimiser toute agrégation pouvant se produire.

27la contamination de la protéine de fusion purifiée par des protéines de cellules hôtes d’E. coli indique que la sonication a été trop sévère. Si des fragments dégradés de la protéine de fusion sont présents, essayez d’ajouter des inhibiteurs de protéase supplémentaires au tampon de lyse. Gardez tous les échantillons, tampons et tubes de collecte au froid pour minimiser la protéolyse. Si une dégradation se produit pendant l’expression de la protéine, essayez d’induire l’échantillon tardivement (~ 0.8 OD600) et diminuer la durée de la période d’induction. Le passage à une autre souche hôte peut également aider.

28une alternative à la digestion en solution est le clivage protéase de la protéine de fusion lorsqu’elle est liée à la matrice du glutathion Sépharose. La protéine de fusion est extraite et chargée sur le glutathion Sépharose suivi d’un lavage avec du PBS (voir Purification d’affinité de la protéine de fusion GST, étapes 1 à 11). Plutôt que d’éluer la protéine avec du tampon glutathion, une solution de PBS contenant l’enzyme est chargée sur la colonne et incubée pendant plusieurs heures à température ambiante (4 °C pour la protéase de prescription). La protéine clivée est ensuite éliminée de la colonne par plusieurs volumes de colonne de PBS. La protéine de fusion résiduelle et la fraction GST peuvent être éliminées de la colonne en lavant la colonne avec un tampon réduit de glutathion. La quantité d’enzyme et le temps d’incubation doivent être déterminés empiriquement pour chaque protéine de fusion. Analysez tous les échantillons par PAGE SDS pour déterminer l’efficacité du clivage et la pureté des protéines.

29dans un clivage par protéase en mode batch, ajouter une quantité d’enzyme déterminée empiriquement à la protéine de fusion liée à la résine (voir Note 15 a–d). Utilisez 1 ml d’enzyme contenant du PBS par ml de volume de lit. Incuber à température ambiante pendant plusieurs heures sous agitation douce. Centrifuger 500 × g pendant 5 min pour sédimenter la résine. Retirez le super qui contient la protéine cible dans un tube séparé. Lavez le glutathion Sépharose avec du PBS jusqu’à 3 fois pour récupérer la protéine de fusion clivée. Incuber la résine avec du tampon glutathion pour éliminer la GST et la protéine de fusion résiduelle. Utiliser 1 ml de tampon glutathion par ml de résine. Centrifuger 500 × g et récupérer la TPS éluée. Répétez jusqu’à 3 fois. Analysez des échantillons par PAGE SDS.

30Si en utilisant la thrombine protéase, la digestion peut être effectuée dans le tampon glutathion utilisé pour éluer la protéine de la colonne. Si vous utilisez le facteur Xa, il est recommandé de dialyser la protéine dans un tampon Tris ou un tampon PBS avant la digestion; le glutathion présent dans le tampon d’élution peut perturber les ponts disulfures présents dans le facteur Xa, entraînant une digestion inefficace des protéines de fusion. Une détermination empirique des conditions de digestion pour chaque protéine de fusion doit être déterminée dans une expérience pilote de digestion. Une méthode pratique consiste à digérer 100 µg de protéine de fusion sur une gamme de rapports enzyme / substrat et à faire varier le temps d’incubation. Les temps d’incubation typiques vont de 2 à 8 heures. Les rapports enzyme / substrat recommandés pour la thrombine sont les suivants 1:100, 1:350, 1:1000, et 1:3000 (unités d’enzyme par µg de protéine de fusion), et pour le facteur Xa sont 1:10, 1:25, 1:50, 1:100, 1:300 ( µg d’enzyme par µg de protéine de fusion). Aux moments souhaités, retirer 2 µg de protéines et arrêter la digestion en ajoutant l’aliquote d’échantillon au tampon d’échantillon SDS bouillant. Analysez les échantillons par PAGE SDS pour déterminer les conditions de clivage optimales. En plus du rapport enzyme/substrat et du temps, envisagez de modifier les conditions du tampon, telles que l’augmentation ou la diminution de la concentration de NaCl ou l’ajout de Ca2 + au tampon (voir la note 31 pour les conseils de dépannage).

31Si plusieurs bandes sont observées sur la PAGE SDS pour la protéine cible après digestion, vérifiez la séquence de la protéine cible pour les sites potentiels de reconnaissance de la protéase secondaire. Si des sites de clivage secondaires existent, re-clonez dans un vecteur différent. Si aucun clivage n’est observé, vérifiez la séquence d’ADN pour vérifier la présence et l’intégrité du site de clivage attendu de la protéase. Assurez-vous que les inhibiteurs de protéase ont été complètement retirés du tampon. Ajouter plus d’enzymes et/ou augmenter les temps d’incubation jusqu’à la nuit. Si la digestion reste incomplète aux ratios enzyme/substrat les plus élevés et aux points de temps les plus longs, envisager de réingénier le site de clivage de la protéase pour inclure plusieurs glycines entre la fraction GST et la protéine cible afin de diminuer la probabilité qu’un obstacle stérique interfère avec le clivage (19, 20).

32 Si l’inhibition de l’enzyme une fois la digestion terminée à l’aide d’inhibiteurs de la sérine protéase n’est pas souhaitable, l’échantillon peut être appliqué sur une colonne de benzamidine HiTrap pour éliminer l’enzyme de l’échantillon.

33Si l’échantillon doit être re-chromatographié sur la colonne de glutathion sépharose pour éliminer la GST et toute protéine de fusion non digérée, il est essentiel que le glutathion réduit soit complètement éliminé de l’échantillon. Le glutathion s’équilibre très lentement à travers les membranes de dialyse; par conséquent, si un tube de dialyse avec un MWCO < 12 000 est utilisé, 3 changements ou plus de tampon peuvent être nécessaires pour un retrait complet. Une augmentation du temps de dialyse (pendant la nuit) et un volume de tampon plus important peuvent également être nécessaires pour de grands volumes d’échantillons.

34la même colonne de glutathion sépharose peut être utilisée à la fois pour l’isolement initial de la protéine de fusion et pour la repurification après clivage enzymatique. Il est recommandé de consacrer une colonne unique à une construction protéique individuelle pour éviter une contamination croisée potentielle de différentes protéines recombinantes. Les colonnes peuvent être réutilisées plusieurs fois. Si l’efficacité de la liaison diminue avec le temps, nettoyez la colonne conformément aux recommandations du fabricant. Si l’activité de liaison n’est pas restaurée, une nouvelle colonne doit être utilisée.

35une liaison maximale se produit si la colonne est complètement réduite; toutefois, si la colonne de glutathion Sépharose a été lavée moins de 48 h avant cette étape, cette étape peut être sautée.

36la protéine cible sera dans la fraction non liée et la TPS et toute protéine de fusion non clivée se lieront à la colonne.

37les petits volumes d’échantillons sont recommandés pour une bonne résolution des protéines cibles par rapport aux autres contaminants. S’il n’est pas possible de concentrer l’échantillon dans un petit volume, des injections multiples de l’échantillon peuvent être effectuées.