PMC

Le CPV-2 est le principal agent étiologique de la gastro-entérite virale chez le chien. C’est un membre de la famille des Parvoviridae, appartenant au genre des Protoparvovirus et aux espèces de Protoparvovirus de type 1. C’est un virus non enveloppé avec un génome d’ADN monocaténaire, qui code pour deux protéines de capside, VP1 et VP2, nécessaires à l’assemblage et au conditionnement du génome viral, ainsi que pour les protéines non structurales NS1 et NS2, qui aident à contrôler la réplication de l’ADN, l’assemblage et la régulation de l’expression des gènes.

Au cours des dernières années, CPV-2 a développé de nouveaux variants antigéniques. En 1980, la souche d’origine du CPV-2 a été remplacée par la variante désignée type 2a (CPV-2a), en 1984, le CPV-2b a été identifié et en 2001, le CPV-2c a été détecté et signalé en Italie. La dernière variante a également été identifiéeen Asie, en Afrique et en Amérique. En raison de l’existence de multiples variants antigéniques pour le CPV-2, les signes cliniques peuvent varier considérablement.Par la suite, les vétérinaires ont moins de certitude lors de la délivrance de leur diagnostic présuntif, et généralement, certains tests de laboratoire sont nécessaires pour confirmer leur diagnostic; bien que plusieurs techniques aient été développées dans des laboratoires de recherche, telles que les dosages d’hémagglutination, l’immunofluorescence, l’ELISA, la PCR, le test d’immunochromatographie et la culture cellulaire (entre autres), les techniques les plus disponibles dans les laboratoires cliniques des hôpitaux vétérinaires ne sont que le test d’immunochromatographie et la PCR, cependant, dans la recherche sur la sensibilité et la spécificité de ces procédures, les rapports sont controversés.De plus, chez les patients présentant divers degrés de gravité de la maladie, la sensibilité et la spécificité de ces techniques n’ont pas été largement étudiées.

L’objectif de cette étude est de rapporter les avantages et les inconvénients offerts par le test d’immunochromatographie et la PCR pour le diagnostic des patients présentant une grande diversité de signes cliniques du CPV-2.

Cette étude a été menée selon les directives de la Norme officielle mexicaine de Recherche sur les animaux expérimentaux NOM-062-ZOO-1999.

Les chiens atteints d’entérite clinique hospitalisés à l’Hôpital Vétérinaire pour Petits Animaux de l’Universidad Autónoma de Estado de México ont été dépistés pour cette étude et sélectionnés sur la base du CPV-2 testé positif ou négatif à l’aide d’une PCR imbriquée (nPCR). En conséquence, 45 chiens testés positifs ont été sélectionnés et 5 chiens testés de manière négative ont été inclus comme témoins. Les 50 chiens ont été examinés cliniquement par trois vétérinaires simultanément pour obtenir la sensibilité du diagnostic clinique. Chaque vétérinaire a émis son diagnostic présumé de manière discrète, en utilisant le dossier médical vétérinaire axé sur les problèmes (POVMR) comme outil de diagnostic.

Ensuite, des échantillons fécaux de tous les chiens ont été analysés par PCR et immunochromatographie, tandis que des échantillons de sang ont été utilisés pour effectuer une numération formule sanguine complète.

Le nPCR est considéré comme une technique hautement fiable et sensible pour identifier les particules virales du CPV-2 et, par conséquent, dans cette étude, la sensibilité des tests utilisés a été corrélée à celles obtenues précédemment à partir du nPCR, pour le diagnostic du CPV-2.

Des échantillons de selles de chien ont été obtenus à l’aide d’écouvillons rectaux, qui ont été mis en suspension dans de l’eau sans nucléase et 200 µl des homogénats, et ont été utilisés pour l’extraction de l’ADNU. La procédure a été réalisée à l’aide du kit d’extraction d’ADN de selles d’ADN QIAamp® (QIAGEN, Mayence, Allemagne), en suivant les instructions du fabricant. Tous les échantillons d’ADN ont été quantifiés à l’aide d’un spectrophotomètre Quawell Q5000 (Quawell Technology, Inc., San Jose, Californie, États-Unis). 100 ng d’ADN de chaque échantillon ont été utilisés pour des réactions de PCR avec 50 µl de volume final. Auparavant, une paire d’amorces a été conçue dans notre laboratoire pour amplifier un fragment de 275 pb, ParvoInt2FB (5′-TCAAGCAGATGGTGATCCAAG-3′) et ParvoInt2CR (5′-GGTACATTATTTAATGCAGTTA-3′) situé aux nucléotides 1,107–1,130 et 1,360–1,382 du gène VP2 (numéro d’adhésion de la banque de gènes FJ0051962c).Des réactions de PCR

ont été réalisées en utilisant 2 µl de chaque amorce (200 nM), 12,5 µl de GoTaq® Green Master Mix (Promega, Madison, WI, U.S.A.) contenant de l’ADN polymérase, un Tampon réactionnel (pH 8,5) et 400 µM de chaque nucléotide (dATP, dGTP, Dctp et dTTP); 3 mM de MgCl2.et 28.5 µl d’eau sans nucléase. Toutes les réactions ont été réalisées dans les conditions d’amplification suivantes : 1 cycle à 94°C pendant 5 min pour la dénaturation initiale, suivi de 35 cycles à 94°C pendant 30 sec, 52°C pendant 1 min, 72°C pendant 1 min et un cycle d’extension final à 72°C pendant 5 min.

Le nPCR a été initialement réalisé en amplifiant un fragment de 1 740 pb à l’aide d’amorces ParvoExt1f (5′-ATGAGTGATGGAGCAGTTCA-3′) et ParvoExt3R (5′-AGGTGCTAGTTGAGATTTTTCATATAC-3′), et ont été conçus en utilisant les séquences nucléotidiques 1-20 et 1 712-1 740 du gène VP2 pour le parvovirus canin (Numéro d’accès GenBank FJ0051962c). La réaction a été normalisée à un volume final de 50 µl.

Le mélange réactionnel contenait 1 µl d’ADN Polymérase GoTaq® Flexi 5 U/µl (Promega), 5 µl de tampon GoTaq® Flexi 5XGreen, 3 µl de MgCl2 25 mM, 4 µl de dNTP 200 µM, 2 µl d’amorces, 10 µl d’ADN avec une concentration finale de 100 ng et 23 µl d’eau sans nucléase. La réaction a été réalisée dans les conditions d’amplification suivantes : 1 cycle à 94°C pendant 5 min, suivi de 35 cycles à 94°C pendant 30 sec, 50°C pendant 45 sec, 72°C pendant 1 min et 1 cycle à 72°C pendant 5 min. Ensuite, 1 µl du produit de cette réaction a été utilisé comme matrice d’ADN pour la procédure d’imbrication, et les conditions d’amorçage et d’amplification étaient les mêmes pour le fragment de 275 pb.

Tous les produits d’amplification ont été identifiés par électrophorèse horizontale dans des gels d’agarose à 2% colorés avec 0,5 µg/ml de bromure d’éthidium et visualisés avec un transilluminateur UV.

Pour l’analyse du test d’immunochromatographie du parvovirus canin (CPV Ag), le kit ANIGEN® (Bionote Inc., Gyeonggi-do, Corée) a été utilisé. Chaque test a été effectué en suivant les instructions du fabricant.

Des échantillons de sang ont été prélevés dans la veine jugulaire à l’aide de tubes de vacutainer contenant de l’EDTA comme anticoagulant. La numération globulaire complète (CBC) a été réalisée à l’aide d’un compteur de cellules anautomatées (QBC vet – IDEXX Laboratories, Inc., Westbrook, États-Unis). Les films sanguins ont été colorés avec Wright-Giemsa et examinés sous un microscope photonique. Une leucopénie a été envisagée lorsque le nombre total de CBC était inférieur à 6 × 103/ µl.

L’analyse des résultats a été réalisée à l’aide d’une matrice pour les variables codées, et des tableaux de contingence ont été créés pour déterminer les propriétés du test de diagnostic. De plus, la statistique Kappa a été déterminée pourestimer l’accord entre les trois tests utilisés et le nPCR. La valeur kappa a été caractérisée selon Kantere et ses collègues en 2015, où la valeur Kappa 1 indique un accord absolu, tandis qu’une valeur de 0 indique qu’un accord se produit par hasard. En général, les valeurs de Kappa supérieures à 0,6 indiquent un bon niveau d’accord; l’analyse a été réalisée à l’aide du package statistique SPSS Ver. 22.0 (IBM, Inc., Armonk, NY, États-Unis).

Quatre-vingt-onze points un (91,1) % des chiens positifs au CPV-2 par nPCR étaient de race pure; 95.5% des patients avaient entre deux et huit mois et 4,5% étaient plus âgés d’un an. En ce qui concerne leur statut vaccinal, 40% ont été vaccinés au moins une fois pour prévenir l’infection par le CPV-2.

La fréquence des signes cliniques montrés par ces chiens était la suivante: 44,4% présentaient des vomissements et de la diarrhée; 20% avaient de la fièvre, des vomissements et de la diarrhée (catarrhale ou hémorragique); 17,7% présentaient uniquement de la diarrhée; 8,8% présentaient uniquement des vomissements; et 4,4% avaient de la diarrhée et de la fièvre, et 4,4% présentaient des vomissements et de la fièvre.Une leucopénie a été observée chez 48,8 % des chiens (tableau 1).

À l’aide d’un examen clinique, les vétérinaires n’ont diagnostiqué que 57,8% des patients positifs au CPV-2 et 100% des chiens négatifs; par conséquent, la valeur de sensibilité pourle diagnostic clinique a été estimée à 57,7% (CI0,95 42,2–72) et la spécificité observée était de 100% (CI0,95 46,2–98,8).

En ce qui concerne le diagnostic des tests de laboratoire, sur 100% des chiens ayant obtenu un résultat positif par nPCR, seuls 30/45 de ces patients étaient positifs au CPV-2 par test immunochromatographique, tandis que les cinq patients témoins ayant obtenu un résultat négatif au CPV-2 ont été correctement diagnostiqués. Par conséquent, cette technique a montré une sensibilité de 66,6% (CI0,95 50,9–79,5) et la spécificité observée était de 100% (CI0,95 46,2–98,8).

En utilisant la technique de PCR, 36/45 patients ont été positifs au CPV-2, et les cinq patients témoins ont été confirmés négatifs tout au long du nPCR. Ainsi, la PCR a démontré une asensibilité de 80% (CI0.95 63,1–87,7) et une spécificité de 100% (CI0.95 67,8–99,1) (Fig. 1).

L’accord entre les trois techniques est démontré par la valeur de Kappa (tableau 2).

La gastro-entérite causée par le CPV-2 est considérée comme l’une des principales maladies virales qui affectent les chiens. Bien que les signes cliniques d’infection à parvovirus canin puissent varier, les signes les plus courants rapportés étaient: anorexie, dépression, léthargie, fièvre, diarrhée mucoïde et hémorragique et leucopénie; dans les cas subcliniques, certains de ces signes peuvent ou non être présents.

Au cours de l’examen clinique, une variabilité des manifestations cliniques de l’infection a été observée. Seulement 20% des chiens étudiés présentaient des signes typiques comme ordinairement décrits dans la littérature. La variabilité clinique de cette maladie a déjà été rapportée et certains auteurs ont discuté de facteurs tels que l’âge, le statut immunitaire, la voie d’exposition, la dose virale, la virulence des souches et la co-infection avec d’autres agents infectieux comme causes possibles. Cela complique l’obtention d’un diagnostic précis de CPV-2 lorsque les vétérinaires se fient uniquement à leur examen clinique. Par conséquent, en ce qui concerne notre enquête basée uniquement sur cette procédure, 42,2% des chiens auront un diagnostic de CPV-2 faussement négatif.Grâce aux dossiers médicaux des chiens de cette étude, nous avons observé que les vétérinaires excluaient la possibilité d’une infection principalement parce que les chiens ne présentaient pas les signes cliniques classiques décrits dans la littérature, avaient été vaccinés contre le CPV-2 et / ou étaient des adultes. Cependant, la plupart des chiens de notre étude présentaient des signes atypiques. Par conséquent, nous pensons que les infections subcliniques du CPV-2 sont plus fréquentes, et les vétérinaires, qui doivent décider d’utiliser ou non des tests de diagnostic supplémentaires avec une sensibilité et une spécificité élevées, devraient sérieusement considérer ces résultats.

Dans cette étude, 40% des patients positifs à la CVP-2 avaient déjà été vaccinés. Il est bien connu que la technique de PCR est très sensible et, par conséquent, elle détecteparticles virales vaccinales dans les fèces de patients récemment vaccinés; des études indiquent qu’il est possible d’obtenir des résultats faussement positifs des jours 3 à 10post-vaccination avec un vaccin CPV vivant modifié. Par conséquent, pour effectuer cette étude, les patients ayant des antécédents de vaccination au cours des 15 jours précédents ont été exclus. De plus, des échantillons de chiens vaccinés positifs au CPV-2 ont été séquencés et, dans tous les cas étudiés, le CPV-2c génovariant a été identifié (les données ne montrent pas), ce qui implique que les chiens ont été infectés par le CPV-2c sur le terrain, sachant qu’aucun vaccin CPV-2cv n’est encore disponible au Mexique. De plus, au Mexique, Pedroza et ses collègues ont rapporté que le variant antigénique le plus courant chez les chiens infectés était le CPV-2c.

D’autre part, de nombreux vétérinaires considèrent la présence de leucopénie, un facteur de soutien pour le diagnostic de CPV-2. Cependant, nous avons observé que seulement 48.8% (22/45) des chiens étudiés ont présenté une leucopénie lors de l’évaluation, ce qui est cohérent avec d’autres rapports indiquant qu’environ 50% des chiens ne présentaient pas de troubles hématologiques au moment de l’évaluation. Par conséquent, un CBC est un outil précieux qui peut fournir des informations sur la gravité de la maladie, suggérant un pronostic et déterminant la réponse au traitement. Cependant, la leucopénie ne doit pas être considérée comme un outil de diagnostic du CPV-2, car elle ne fournit pas de preuve de la présence du virus.

Diverses techniques d’identification virale sont utilisées pour la confirmation définitive de l’infection par CPV-2, par exemple, des tests rapides basés sur l’immunochromatographiesont largement utilisés par les cliniciens, car la procédure est facile, rapide et accessible. De plus, il ne nécessite pas de préparation d’échantillon ou d’envoi à un laboratoire spécialisé pour analyse. La sensibilité variable de ce test est son inconvénient; plusieurs études ont indiqué que sa sensibilité varie de 50 à 100%, et dans notre étude, la sensibilité comparative avec le nPCR était de 66,6%. Certaines études ont suggéré que la faible sensibilité technique est due à la nécessité de verser de grandes quantités de particules virales dans les selles des chiens pour obtenir un diagnostic positif. L’utilisation de cette technique doit être reconsidérée, car une probabilité plus élevée de résultats faussement négatifs est attendue. Pour éviter cela, d’autres techniques, avec des sensibilités plus élevées, doivent être utilisées.

Plusieurs études ont démontré la sensibilité élevée des tests basés sur la PCR; actuellement, il existe plusieurs variantes d’une même procédure qui offrent des sensibilités de 80 à 100%. Dans la présente étude, la PCR avait une sensibilité de 80%, et il est à noter de mentionner que les patients n’ont été identifiés que positifs à l’infection par nPCR, tandis que ni la PCR ni les tests d’immunochromatographie n’ont pu l’identifier.

En ce qui concerne la valeur kappa, nous avons comparé les résultats des trois méthodes analysées au nPCR. Le mauvais accord entre le diagnostic clinique et le NPCR a néanmoins été démontré; un accord modéré a été observé entre la PCR conventionnelle et le nPCR, ce qui peut être dû à la similitude entre les deux tests.

En ce qui concerne les signes cliniques, la présence de vomissements ou de diarrhée a été observée chez tous les patients infectés par des virus, tandis que d’autres signes cliniques n’étaient pas considérés comme pertinents pour l’infection; en accord avec les signes cliniques et la sensibilité des techniques utilisées, aucune relation n’a été observée. Par exemple, le cas no 26 n’a montré que des vomissements en tant que signe clinique, et il a été jugé négatif pour le CPV-2 par un diagnostic clinique vétérinaire, cependant, les tests d’immunochromatographie, la PCR et les tests NPCR étaient positifs pour le CPV-2. De plus, les cas 41 et 42 dans lesquels le signe clinique principal était la diarrhée n’ont pu être diagnostiqués positifs au CPV-2 qu’en utilisant le nPCR.

Nos données indiquent que les tests diagnostiques les plus fréquemment utilisés dans les laboratoires vétérinaires cliniques et diagnostiques pour détecter le CPV-2 sont très spécifiques, mais ils sont peu sensibles, ce qui empêche le diagnostic précis du CPV-2. Dans notre étude, la PCR et le test d’immunochromatographie n’étaient pas aussi sensibles que le nPCR, ce qui a été confirmé dans des études antérieures, cependant, l’utilisation du nPCR comme test de diagnostic n’est pas encore largement répandue dans les hôpitaux vétérinaires, alors qu’il reste largement utilisé à des fins de recherche.

En revanche, la PCR en temps réel, qui est également très sensible, est rarement utilisée, en raison de ses coûts d’équipement élevés et de l’exigence d’un personnel hautement spécialisé pour sa manipulation. Cependant, les progrès technologiques ont permis à ces techniques de devenir moins chères et plus simples à utiliser, ce qui pourrait conduire à leur application directe dans les hôpitaux vétérinaires pour améliorer la précision diagnostique du CPV-2.